biotechnologia


 
 
UWAGA. Artykuł jest poniżej.

Drodzy Czytelnicy e-biotechnologia.pl. Mamy do Was ogromną prośbę!



Portal ten tworzony jest przez lubelskich naukowców i od ponad 10 lat staramy się, aby w Wasze ręce trafiały treści, które pomagają Wam w zdobywaniu wiedzy.
Dzisiaj My prosimy Was o pomoc i przysługę!
Ci sami naukowcy, którzy tworzą e-biotechnologia.pl tworzą również projekt NEXBIO.
NEXBIO rozwija technologie analizy DNA, które mają szansę obniżyć użycie pestycydów w rolnictwie. Ponadto budujemy mobilne laboratorium genetyczne, które umożliwi wykrywanie chorób roślin już na polu. Więcej o nas tutaj: Onet Rano, INN:Poland, Chivas Venture NEXBIO.

NEXBIO reprezentuje Polskę w niezwykle prestiżowym konkursie THE VENTURE rywalizując w gronie 30 innowacyjnych pomysłów z całego świata. Mamy szansę wygrać, ale nie odbędzie się to bez Waszej pomocy. Prosimy Was o głosy w konkursie. To dla nas wielka szansa! Dla nas to fundusze na rozwój projektu jakim jest mobilne laboratorium genetyczne. Jeśli nas wesprzecie, bardzo prawdopodobne jest, że za kilka lat, również będziecie z niego korzystać.

Jak można na nas zagłosować (to zajmie tylko kilka sekund!):


1. Należy wejść na stronę organizatora konkursu: Konkurs The Venture
2. Kliknąć w przycisk Zaloguj się przez Facebook aby oddać głos
3. I następnie koniecznie kliknąć w przycisk Potwierdź swój głos

Bardzo Wam dziękujemy!
ZESPÓŁ E-BIOTECHNOLOGIA.PL
 

Drożdżowy system dwuhybrydowy

drożdżowy system dwuhybrydowy IBB PAN PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Fragment skryptu: Biologia molekularna roślin

Uniwersytet Warszawski (www)
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN (www)
Zakład Biologii Molekularnej Roślin (www)
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

Adres:
ul. Pawińskiego 5a,
02-106 Warszawa

Kontakt: tel. (+48 22) 592 5704,
E-mail: andyj@ibb.waw.pl


Zakład Biologii Molekularnej Roślin

Problematyka badawcza: Rola struktury chromatyny w regulacji rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na czynniki stresowe i hormonalne. Prowadzone aktualnie badania mają na celu poznanie funkcji roślinnych kompleksów remodelujących chromatynę, histonu H1 i modyfikacji potranslacyjnych histonów rdzeniowych, a także opisanie proteomu jądrowego rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.
Stosowane techniki: Większość metod biologii molekularnej, metody biochemii białek, analiza proteomiczna (mass-spec) i transkryptomiczna (mikromacierze), genetyka Arabidopsis thaliana (konstrukcja i analiza mutantów), metody bioinformatyczne.
_______________________________________________________________________________


Badanie oddziaływań białek - drożdżowy system dwuhybrydowy


Drożdżowy system dwuhybrydowy (ang. Yeast Two Hybrid) służy do badania oddziaływań między dwoma potencjalnymi partnerami białkowymi. W technice tej wykorzystuje się fakt, że wiele eukariotycznych czynników transkrypcyjnych zawiera dwie funkcjonalnie niezależne domeny. Jedna z nich wiąże się z DNA (BD, ang. Binding Domain), druga natomiast aktywuje transkrypcję danego genu (AD, ang. Activation Domain). Obie te domeny są zatem niezbędne aby nastąpiła transkrypcja określonego genu. W drożdżowym systemie dwuhybrydowym każda z tych domen zostaje połączona z jednym z potencjalnych i będących przedmiotem badań, partnerów białkowych. W efekcie powstają dwa tzw. białka fuzyjne: jedno z nich związane z domeną wiążącą się z DNA (BD), drugie zaś z domeną aktywującą transkrypcję (AD).

Geny kodujące oba fuzyjne białka znajdują się na dwóch różnych plazmidach. Plazmidy te wprowadza się do komórek drożdży, zatem oba białka podlegają ekspresji w tej samej komórce. Jeżeli badane białka oddziałują ze sobą, obie domeny: aktywująca transkrypcję (AD) i wiążąca się z DNA (BD), zbliżają się do siebie na tyle blisko, by móc aktywować transkrypcję konkretnego genu. W opisywanym układzie genem, który ulega transkrypcji jest jeden z genów reporterowych, np. gen kodujący β-galaktozydazę (lac-Z) lub HIS3.

Metoda dwuhybrydowa polega na wykorzystaniu dwudomenowej struktury białka, aktywatora GAL-4. Aktywator ten składa się z domeny aktywującej transkrypcję genu i z domeny wiążącej się do rejonu promotorowego – UAS genu GAL1. Genem reporterowym jest lacZ. Używane są dwa wektory, które po wprowadzeniu do komórek drożdży dają dwa białka fuzyjne w dwóch niezależnych układach:





Rys. 1 Schemat działania drożdżowego systemu dwuhybrydowego.


- pGAD424 zawierający domenę aktywującą (AD) i sekwencję kodującą białko FCA oraz pGBT9 zawierający domenę wiążącą się z DNA (BD) i sekwencję kodującą drugie białko AtSWI3B.

- pGAD424 zawierający domenę aktywującą (AD) i sekwencję kodującą białko AtSWI3B oraz pGBT9 zawierający domenę wiążącą się z DNA (BD) i sekwencję kodującą białko FCA.

Jeśli białko X oddziałuje z białkiem Y, gen reporterowy kodujący β-galaktozydazę ulegnie transkrypcji (Rys. 1). Wówczas aktywne białko β-galaktozydazy w obecności podanego z zewnątrz substratu, którym jest X-gal (5-bromo-4-chloro- 3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd) przeprowadzi reakcję, w wyniku której powstanie niebieski produkt.

System dwuhybrydowy może być wykorzystywany jako metoda ilościowa. To znaczy można oceniać siłę oddziaływań, a nie tylko stwierdzać ich obecność lub brak. Metoda ilościowa jest wykorzystywana bardzo rzadko, z uwagi na liczne ograniczenia wynikające m. in. z różnic w produkcji białka między poszczególnymi koloniami drożdżowymi, a także różnic w tolerowaniu danego białka przez komórkę drożdżową np. toksyczność białek. Ograniczenia te mogą powodować niedokładności w wynikach.

Schemat metody ilosciowej: (należy ustalić takie same ilości białka we wszystkich próbkach

- Pomiar gęstości komórek drożdżowych (spektrofotometr)
- Pomiar ilości białka (metoda Bradford)
- Badanie aktywności β-galaktozydazy poprzez pomiar ilości barwnego produktu na płytkach wielodołkowych (czytnik spektrofotometryczny)


Zastosowanie systemu dwuhybrydowego


Drożdżowy system dwuhybrydowy można używać zarówno do badania kierunkowych oddziaływań między dwoma białkami, jak również do poszukiwania nowych, nieznanych partnerów danego białka. W pierwszym przypadku należy skonstruować dwa plazmidy, z których eksprymowane będą dwa białka fuzyjne: jedno z domeną aktywującą, zaś drugie z domeną wiążącą. Używając odpowiednich starterów z zaprojektowanymi miejscami cięcia przez enzymy restrykcyjne należy wykonać reakcję PCR na matrycy cDNA. Otrzymane fragmenty DNA trzeba następnie zligować z odpowiednio przygotowanymi plazmidami, jednym kodującym domenę wiążącą, a drugim - domenę aktywującą, pamiętając o zachowaniu właściwej ramki odczytu. Po uzyskaniu właściwych plazmidów należy stransformować nimi odpowiedni szczep drożdży, np. Y190, HF7c czy CG-1945, które mają uszkodzony szlak syntezy leucyny i tryptofanu i potrzebują tych aminokwasów do wzrostu.

Po transformacji dwoma plazmidami drożdże wysiewa się na odpowiednią pożywkę selekcyjną. Uzyskane kolonie przeszczepia się na nową szalkę i następnie przeprowadza się test dwuhybrydowy.

Drugim zastosowaniem drożdżowego systemu dwuhybrydowego jest poszukiwanie nieznanych partnerów konkretnego białka. W tym celu można przeszukiwać całą bibliotekę cDNA w określonym wektorze z domeną aktywującą za pomocą interesującego nas białka, wyrażanego z plazmidu z domeną wiążącą. Zarówno plazmid kodujący białko będące „przynętą” (ang. Bait plasmid) którego partnerów chcemy poznać, jak i całą bibliotekę cDNA tworzy się w analogiczny sposób jak w przypadku kierunkowego systemu dwuhybrydowego. Przy przeszukiwaniu biblioteki łatwiej jest przeprowadzić wstępną selekcję ewentualnych partnerów badanego białka przed właściwym testem na obecność β-galaktozydazy. W wielu systemach wykorzystuje się zatem obecność drugiego genu reporterowego, tym razem pokarmowego, np. genu HIS3, kodującego enzym niezbędny w szlaku biosyntezy histydyny.

Ponieważ transformacje pojedynczymi plazmidami są wydajniejsze od transformacji podwójnych, można też najpierw stransformować drożdże plazmidem kodującym „przynętę”, wysiewając je na odpowiednie podłoże selekcyjne i po uzyskaniu komórek zawierających jeden plazmid wprowadzić do nich plazmidy biblioteki. Po wstępnej selekcji na podłożu bez histydyny wyrosną kolonie, w których nastąpiła aktywacja transkrypcji genu HIS3. Dopiero na tych koloniach należy przeprowadzić test na obecność β-galaktozydazy w komórkach drożdży. Dzięki tej metodzie można stosunkowo szybko wykryć nowych partnerów białkowych dla interesującego nas białka. Ponadto, należy podkreślić, iż w systemie dwuhybrydowym możliwe jest badanie oddziaływań między białkami, które normalnie występują w komórce w małych ilościach, zatem trudno je sprawdzić innymi metodami, zaś w drożdżach białka fuzyjne eksprymowane z plazmidów wystąpią w ilości wystarczającej do wykonania testu.


Ograniczenia systemu dwuhybrydowego


Główną wadą systemu dwuhybrydowego jest fakt, iż z różnych przyczyn oddziaływań niektórych klas białek nie można zbadać za jego pomocą. Z pewną częstotliwością pojawiają się wyniki fałszywie pozytywne i fałszywie negatywne.

Te pierwsze są najczęściej powodowane przez białka, które, kodowane przez plazmid z domeną wiążącą, są aktywatorami transkrypcji i do aktywacji genu reporterowego nie potrzebują oddziaływania z drugim białkiem fuzyjnym zawierającym domenę aktywującą. Z tego powodu biblioteki cDNA tworzone do przeprowadzania wysokowydajnych analiz dwuhybrydowych są prawie zawsze tworzone w plazmidach kodujących domenę aktywującą, aby białka będące aktywatorami transkrypcji nie powodowały fałszywych wyników pozytywnych. Poza tym zdarzają się też oddziaływania niespecyficzne których wynikiem jest aktywacja genu reporterowego. Ich przyczyny mogą być różne. Niektóre białka fuzyjne z domeną aktywującą mogą oddziaływać z białkiem drożdżowym zawierającym domenę wiążącą i w ten sposób aktywować transkrypcję u drożdży. Analogicznie, białko fuzyjne z domeną wiążącą może, poprzez oddziaływanie z drożdżowym białkiem z domeną aktywującą, aktywować transkrypcję u drożdży. Te dwa przypadki fałszywie pozytywnych wyników systemu dwuhybrydowego można wyeliminować, stosując odpowiednie kontrole negatywne.

W tym celu równolegle do transformacji drożdży plazmidami kodującymi białka fuzyjne należy przeprowadzić transformację plazmidem kodującym białko fuzyjne z domeną-AD z pustym plazmidem kodującym domenę-BD lub kodującym inne białko fuzyjne o którym wiadomo że nie oddziałuje z badanym białkiem fuzyjnym. Analogicznie należy przeprowadzić kontrolę dla białka fuzyjnego z domeną-BD, kotransformując drożdże plazmidem je kodującym wraz z plazmidem-AD pustym bądź kodującym białko które nie oddziałuje z białkiem z domeną-BD. Jeżeli kontrola negatywna zabarwi się na niebiesko, wiadomo, że mamy do czynienia z wynikiem fałszywie pozytywnym. Istnieje również przypadek artefaktu systemu dwuhybrydowego, którego nie da się wyeliminować stosowaniem kontroli negatywnych. Zdarza się on wtedy, gdy oba białka fuzyjne eksprymowane w drożdżach wprawdzie nie oddziałują ze sobą, ale oddziałują z tym samym białkiem drożdżowym i stąd ich domeny aktywująca i wiążąca mogą się znaleźć na tyle blisko siebie, aby aktywować transkrypcję w drożdżach. Z powodu tej możliwości oddziaływania między dwoma białkami stwierdzone w systemie dwuhybrydowym należy jeszcze potwierdzić drugą, niezależną metodą.

Oprócz wyników fałszywie pozytywnych, w systemie dwuhybrydowym zdarzają się również wyniki fałszywie negatywne, tzn. pomimo istnienia oddziaływań nie zostają one wykryte. Tego rodzaju przypadków nie da się wyeliminować stosowaniem kontroli, a spowodowane są one najczęściej niestabilnością danego białka w drożdżach. Poza tym, niektóre białka mogą przybierać w drożdżach niewłaściwą konformację, przez co ich domena wiążąca będzie ukryta i do oddziaływań nie dojdzie. Również niektóre klasy białek, a w szczególności białka błonowe zawierające hydrofobową domenę transbłonową, mogą nie trafić do jądra i wówczas nie dojdzie do aktywacji transkrypcji. Czasami przyczyną otrzymywania wyników fałszywie pozytywnych i fałszywie negatywnych może być też nieprawidłowa hodowla drożdży: zbyt stare drożdże wykazują tendencję do powodowania wyników pozytywnych w teście na obecność β-galaktozydazy. Szczególnie ważne jest również utrzymywanie stabilnej temperatury hodowli drożdży. Z tego powodu wyniki otrzymane w systemie dwuhybrydowym należy potwierdzić za pomocą innych metod, jak np. koimunoprecypitacja (Co-IP). Technika ta polega na dodaniu do mieszaniny obu analizowanych białek, przeciwciała skierowanego przeciwko jednemu z nich.

Jeżeli białka te oddziałują ze sobą można „wyciągnąć” (za pomocą jednego przeciwciała) jednocześnie oba białka (białko wiążące się z przeciwciałem oraz białka, które oddziałują z pierwszym białkiem). Jeśli badane białka nie oddziałują ze sobą, można „wyciągnąć” tylko jedno białko.


Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

163 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Patronat

Wydarzenie: V edycja akcji „Od laika do przyrodnika” 24 lutego -16 czerwca 2017 r., Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Konferencja: IV Lubelska Konferencja Młodych Naukowców, 26-27 Maja 2017, Lublin

Konferencja: VI Międzynarodowa Konferencja Biofizyków, 19-21 Maja 2017, Kraków

Konkurs na projekt badawczy Naukowej Fundacji Polpharmy, 1 marca- 31 maja 2017, Warszawa

Konferencja: VI Międzyuczelniane Sympozjum Biotechnologiczne SYMBIOZA, 26-28 Maja 2017, Warszawa

Konferencja: Chemia dla Urody i Zdrowia
8-10 czerwca 2017, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Wydarzenie: Metagenomy różnych środowisk, 29-30 czerwca 2017, Lublin

Wydarzenie: EUROBIOTECH 6th Central European Congress of Life Science
11 - 14 Września 2017, Kraków

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u