biotechnologia


 
 

Enzymy ekstremofili

Autor artykułu: Maciej Mędraś




Odkrycie termostabilnych polimeraz DNA i ich wpływ na badania, medycynę i przemysł, podkreślił potencjalne korzyści płynące z wykorzystania enzymów wyizolowanych z organizmów żyjących w ekstremalnych warunkach. Od tego czasu gwałtownie wzrosło zapotrzebowanie na enzymy potrafiące stabilnie funkcjonować w trudnych warunkach eksploatacyjnych. Obecnie wiele wysiłków poczyniono w kierunku badań przesiewowych odkrywających nowe źródła enzymów pochodzących z ekstremofili. Równoległy rozwój zaawansowanych narzędzi biologii molekularnej umożliwiła również projektowanie i modyfikowanie właściwości enzymów za pomocą technik mutagenezy, tasowania genów, ukierunkowanego rozwoju, zmian chemicznych i immobilizacji.

Enzymy ekstremofili wykonują te same funkcje enzymatyczne, jak enzymy mezofili, lecz w warunkach, które hamują lub denaturują ich odpowiedniki występujące u mikroorganizmów mezofilnych. Co ciekawe niektóre z enzymów pochodzących z ekstremofili wykazują tzw. poliekstremofilność, czyli stabilność i aktywność w więcej niż jednym ze skrajnych warunków, np. wysokim stężeniu soli, zasadowym pH, niskiej temperaturze i niewodnym otoczeniu.


Ogólna charakterystyka budowy enzymów


Wszystkie enzymy składają się z liniowej sekwencji aminokwasów, połączonych między sobą wiązaniem peptydowym. Jest to tzw. pierwszorzędowa struktura białka. Łańcuchy boczne aminokwasów oddziaływają między sobą za pomocą różnorodnych sił, takich jak wiązania wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne, hydrofobowe czy siły van der Waalsa, tworząc w ten sposób drugorzędową strukturę białka. Te struktury oddziałują między sobą tworząc struktury trzeciorzędowe. Wzajemne interakcje struktur trzeciorzędowych, determinują powstawanie najbardziej złożonych i zaawansowanych przestrzennie struktur, zwanych czwartorzędowymi. To dzięki tworzeniu się takich przestrzennych form, enzymy posiadają unikalne funkcje katalizowania reakcji i specyficznego wiązania się tylko z określonymi substratami. Różnice w budowie pomiędzy enzymami mezofilnymi i tymi z ekstremofili, jeżeli chodzi o budowę, są praktycznie niezauważalne, niezależnie od stopnia sfałdowania. Poniżej znajduje się charakterystyka kilku grup enzymów ektremofilnych gdzie wykazano różnice wpływające na ich odporność.


Charakterystyka budowy enzymów termofilnych


To, co powoduje wzmożoną odporność enzymów termofili jest konsekwencją zamiany niewielkiej ilości aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym, które determinują powstawanie dodatkowych oddziaływań niekowalencyjnych, jednakże nie zakłócają one ogólnej budowy enzymu. Przykładem może być statystyczne porównanie zawartości poszczególnych aminokwasów zawartych w polimerazach mezofilnych i termofilnych. Okazało się, iż w enzymach organizmów termofilnych znaleziono więcej takich aminokwasów jak: alanina, treonina, arginina niż w ich mezofilnych odpowiednikach. Te różnice powodują zwiększoną stabilność enzymów termofilnych.

Ważnym czynnikiem determinującym odmienne od mezofilnych enzymów właściwości, jest mniejsza zmiana entalpii i entropii w temperaturze konwergencji biokatalizatorów termofilnych. Udowodniono to obliczeniami zmiany tych parametrów na jeden aminokwas, przeprowadzonymi u obydwu typów bakterii. Podobnie jest z ciepłem właściwym. Jeśli chodzi o temperaturę maksymalnej stabilności to jest ona podobna w obu grupach organizmów, jednak zmiana energii swobodnej u termofili, jest prawie dwa razy większa niż u mezofili. Udowodniono ponadto, iż istnieje silna zależność pomiędzy stabilnością, a ilością mostków dwusiarczkowych w strukturze enzymów bakterii ciepłolubnych.

Badania struktur białkowych wykazały, że istnieje kilka sposobów, dzięki którym mostki solne mogą stabilizować białka. Są to: tworzenie sieci jonowej, stabilizacja helisy, mostki solne obecne we wnętrzu hydrofobowego rdzenia i solne mostki powierzchniowe łączące dwie podjednostki. Są jednymi z najczęściej spotykanych typów oddziaływań obecnych w tych enzymach. Oprócz mostków solnych za stabilizację odpowiadają inne elektrostatyczne interakcje jak chociażby oddziaływania między dodatnio naładowanymi helisami, a innymi ujemnie naładowanymi resztami aminokwasowymi. Bardzo ważnym czynnikiem odpowiadającym za stabilność termiczną są oddziaływania o dalekim zasięgu. Ich obecność w enzymach termofili jest o wiele częściej spotykana niż w homologicznych biokatalizatorach pochodzących z mezofili.


Charakterystyka budowy enzymów halofilnych


Wysokie stężenie soli zakłóca strukturę wody obecnej wokoło enzymów, co w konsekwencji je destabilizuje. Ale nie zdarza się to w przypadku enzymów halofili. Zaobserwowano w badaniach porównawczych, że nadmiar kwaśnych pozostałości zostaje rozprowadzany na powierzchni enzymu, oraz że znajduje się w nich więcej motków solnych. Inne funkcje strukturalne, które przyczyniają się do stabilizacji tego typu cząsteczek to włączenie alaniny do α-helis oraz wprowadzenie ujemnie naładowanych aminokwasów, które je stabilizują w wyniku interakcji z jej pozytywnie naładowaną częścią. Cząsteczki wody są znane z tego, iż odgrywają kluczową rolę w funkcjach biologicznych białek, poprzez wiązanie się z ich powierzchnią i włączenie do wnętrza samej cząsteczki. Woda ma tendencję do tworzenia struktur w postaci swoistej "klatki" wokół grup hydrofobowych na powierzchni enzymu. Jony soli są znane z zakłócania tej lokalnej struktury wody, zmniejszając liczbę intermolekularnych wiązań wodorowych. Wysokie jej stężenie krytycznie wpływa na rozpuszczalność, wiązanie substratów, stabilność i krystalizacje białek. Również interakcje między białkami i ich podjednostkami w roztworze są zakłócane przez sól. Podobnie jest z elektrostatycznymi interakcjami między naładowanymi aminokwasami, które niosą znaczne konsekwencje dla struktury i funkcji protein. Skala efektów zależy od charakteru chemicznego soli. Woda jest niezbędna do utrzymania natywnej struktury, prawidłowego funkcjonowania i zapobiegania agregacji. Wraz ze wzrostem stężenia jonów soli wewnątrz komórki, woda jest usuwana z hydrofobowych rejonów znajdujących się na powierzchni białka, aż do momentu gdy są one znów dostatecznie uwodnione. Mezofilne makromolekuły nie są w stanie efektywnie konkurować z jonami soli, w wyniku czego tracą swoją unikalną strukturę i aktywność. Jednak halofilne białka są do tego zdolne utrzymując prawidłowe nawodnienie i budowę w obecności wysokich stęż jonów. Cząsteczki te, używają soli w mechanizmie osmotycznej stabilizacji ewoluowały, wykształcając określone cechy molekularne, które pomagają im konkurować z jonami o wodę i utrzymać stabilne nawodnienie powłoki. W rzeczywistości, w porównaniu z nie-halofilnymi enzymami, te odporne na wysokie stężenie soli, posiadają wielowarstwowe powłoki nawadniające, które mają znaczne rozmiary. Innym sposobem mającym na celu zwiększenie aktywności w wysokich stężeniach soli, jest wzrost liczby naładowanych aminokwasów, zwłaszcza kwaśnych, obecnych na powierzchni protein.

Badania bioinformatyczne ekstremalnych halofili wykazały, że wzrost liczby kwaśnych aminokwasów (kwas glutaminowy oraz w mniejszym stopniu, kwas asparaginowy) w porównaniu do reszty typów zawartych w komórkowych proteinach, jest zasadniczą właściwością białek pochodzących z genomu mikroorganizmów halofilnych. Mają one większą niż wszystkie inne zdolność wiązania wody. Zazwyczaj znajdują się w nadmiarze na powierzchni. Część, którą stanowią w ogólnym składzie aminokwasowym może wynosić , aż do 20-23%. Te ujemnie naładowane, wiążą uwodnione kationy i pomagają utrzymać nawilżenie powierzchni, zmniejszając część hydrofobową protein oraz przyczyniając się do ich wzajemnego odpychania elektrostatycznego. Właściwości te zapobiegają agregacji, przy wysokich stężeniach soli, co zostało potwierdzone licznymi analizami. Stwierdzono również, że halofilne białka zawierają niską zawartość aminokwasów o obszernych bocznych hydrofobowych łańcuchach na ich powierzchni. Większa zawartość hydrofobowych aminokwasów (fenyloalaniny, izoleucyny, leucyny) jest kompensowana ilością małych (glicyna i alanina) i tych z pogranicza hydrofobowości (seryny i treoniny). Ustalenia te są także zgodne z teorią większej elastyczność oraz zwiększenia uwodnienia powierzchni dzięki zmniejszeniu powierzchni hydrofobowej halofilnych białek. Przeciwnie naładowane aminokwasy, znajdujące się w sąsiedztwie ulegają często interakcjom w postaci mostków solnych, które odgrywają role w wiązaniu, odpowiedniej strukturze i oligomeryzacji.

Generalnie można wysunąć wniosek iż wysokie stężenie soli w tych proteinach poprawia natywną budowy i ich funkcje. Co ciekawe, usunięcie soli zazwyczaj powoduje stopniową utratę struktury białka i ich denaturację, co wskazuje, iż ten czynnik jest niezbędny do prawidłowej funkcji katalitycznej, a ewolucja wykształciła ścieżkę z której nie ma powrotu i z niekorzystnego życiowo otoczenia stworzyła takie, które jest niezbędne do funkcjonowania.


Cechy charakterystyczne enzymów psychrofili


Tak jak wysokie zasolenie tak i niska temperatura również krytycznie wpływa na właściwości i strukturę enzymów, a także otaczającą je wodę. Niskie temperatury wpływają znacząco na dynamikę międzycząsteczkowej wody, jak również i tej bezpośrednio otaczającej powierzchnię białka. Ponieważ woda działa jak smar, łagodząc dynamikę wiązania peptydowego, jej działanie jest bardzo zależne od temperatury. Stosunek siły wiązań wodorowych do temperatury ma liniowy przebieg, z maksymalną gęstością czystej wody, w temperaturze około 4°C. Zerwanie wiązań wodorowych następuje w wodzie o wysokiej gęstości, podczas gdy silne sieci tych wiązań tworzą się w wodzie o jej niskiej wartości. Niedobory lub zakłócenia w wiązaniach wodorowych i sieci wody wokół białka, mogą powodować utratę aktywności biologicznej i denaturację białka w niskich temperaturach. Wraz ze spadkiem temperatury, cząsteczki wody wokół powierzchni białka stają się bardziej uporządkowane i tym samym mniej z nią związane, przesuwając stan równowagi w kierunku rozkładu lub denaturacji. Ta zmiana w strukturze enzymu jest napędzana przez wzrost energii hydratacji niepolarnych grup w niższej temperaturze. Energia hydratacji ma zwykle mniejszy wpływ na psychrofilne enzymy. W efekcie są one w stanie utrzymać dostępną wodę, podobne do enzymów pochodzących z halofili. Temperatura i lepkość ośrodka są odwrotnie proporcjonalne. Lepkości spada o połowę, gdy temperatura zmniejsza się z 37°C do 0°C. Niskie temperatury zmniejszają także szybkość reakcji, przynajmniej w części, ze względu na silną korelację temperatury i lepkości otoczenia. Na podstawie rozważań biofizycznych reakcji przewiduje się 2-3 krotny spadek szybkości na każde 10°C spadku temperatury. W rezultacie wpływ obniżania temperatury na aktywność enzymu jest bardzo istotny, a struktura prawidłowych form musi mieć pewne dostosowania, do utrzymania poziomu "oddychania" niezbędnego w prawidłowym katalizowaniu reakcji. Badania aktywnych enzymów tych organizmów sugerują, że zarówno wzrost interakcji z rozpuszczalnikiem jak i zwiększenie elastyczności strukturalnej przyczynia się do utrzymania działania katalitycznego w niższych temperaturach. Wykazano, że działalność zimna wpływa ewolucyjnie na niewielkie zmiany w sekwencji białka, szczególnie w obszarach znajdujących się w pobliżu miejsca aktywnego enzymu lub w jego centrum. Istnieje stosunkowo niewiele opracowanych trójwymiarowych struktur białek zimno aktywnych w stosunku do białek mezofilnych lub termofilnych, jednak dostępne przykłady potwierdzają, iż podczas gdy ogólna struktura białek dostosowanych do zimna jest generalnie niemal identyczna w stosunku do ciepłolubnych homologów, różnice występujące między nimi dotyczą ogólnego wzrostu elastyczności białka i interakcji z rozpuszczalnikiem. Naukowcy doszli do wniosku, że utrzymanie właściwej elastyczności ma kluczowe znaczenie dla białek psychrofilnych, determinując ich aktywność do działania w temperaturze ich naturalnego środowiska. Struktura krystaliczna pokazała spadek liczby wiązań wodorowych, jako jedno z głównych kryteriów sprzyjających uzyskaniu tych cech.

Studium bioinformatyczne zawartości aminokwasów, które różnią się pomiędzy proteinami, przystosowanymi do różnych temperatur, które obejmowały prawie 400 białek pochodzących z psychrofili pokazały, że interakcje z rozpuszczalnikiem na powierzchni białka odgrywają ważną rolę w temperaturze adaptacji. Dodatkowe bioinformatyczne symulacje i badania eksperymentalne sugerują, że aktywność zależnych od temperatury enzymów może być uwarunkowana przez zmiany składu aminokwasów, zwłaszcza zmiana jego ogólnego ładunku, zmniejszenie hydrofobowości w samym rdzeniu tego enzymu, lub zmniejszenie liczby wiązań wodorowych, mostków solnych lub jonów związanych na powierzchni. Aminokwasy obecne na powierzchni białka, jak się okazało, odgrywają kluczową rolę zarówno w odporności na zimno jak i wysokie zasolenie, zwiększając aktywność i ulepszając wiązanie substratów przy wyższych stężeniach soli.

Aby zwiększyć elastyczność w obrębie tych enzymów można zaobserwować wiele zmian strukturalnych oraz zniknięcie elektrostatycznych interakcji stabilizujących, natomiast ich wzrost oddziaływań po stronie łańcuchów bocznych znajdujących się na powierzchni, które oddziałują z rozpuszczalnikiem. Wzrost ilości badań, a co za tym idzie liczby opisanych "zimnolubnych" białek aktywnych, oraz porównanie ich ze spokrewnionymi homologami mezofilnymi zapewni szersze spojrzenie na tą część enzymologii i na pewno odkryje szereg nieznanych dotąd aspektów.


Modyfikacje enzymów ektremofili


W ostatnich czasach uwaga i wysiłki nowoczesnej inżynierii białek jest zwrócona w stronę stworzenia zmodyfikowanych enzymów, posiadających cechy tych naturalnie występujących w esktremofilach, lecz przystosowanych do przemysłowego stosowania. Wraz z postępem badań uzyskuje się coraz bardziej zadowalające wyniki, świadczące o tym, iż takie projektowanie jest możliwe i może stanowić szansę dla zrewolucjonizowania wielu, często niezwiązanych ze sobą dziedzin przemysłu, a co za tym idzie wyeliminowania znaczącego w dzisiejszych czasach udziału tradycyjnej technologii chemicznej i generowanych w wyniku jej działalności szkodliwych i niejednokrotnie toksycznych odpadów powstałych po tychże procesach. Istnieje kilka strategii, używanych w celu uzyskania zamierzonego celu.

Ukierunkowana mutageneza
Jest ona jednym z najlepszych sposobów inżynierii enzymów na podstawie wcześniejszej wiedzy na temat podobnych enzymów z ekstremofili. Struktura krystaliczna enzymu zawiera wskazówki do zmiany niektórych aminokwasów, które mogą zwiększać stabilność poprzez wprowadzenie dodatkowych wiązań dwusiarczkowych, zwiększenie hydrofobowości i ilości mostków solnych. Odpowiednie zmiany są wprowadzane na sklonowanej kopii genu. Prawidłowo zmodyfikowany enzym zmienia swoje właściwości w pożądanym kierunku. Ukierunkowana mutageneza jest szeroko stosowana do inżynierii wiązań dwusiarczkowych w przypadku lizozymu T4 oraz poprawy jego stabilności, a także w przypadku kilku innych białek.

Losowa mutageneza
Strategia ta służy tworzeniu losowych mutacji, przez promieniowanie UV lub z zastosowaniem chemicznych czynników mutagennych, w celu wybrania mutantów o zmienionych właściwościach. Nie wymaga wcześniejszej pełnej wiedzy na temat badanego enzymu. Za pomocą tej techniki zostały stworzone termicznie stabilne wersje takich enzymów jak: lizozym T4, czy nukleaza z gronkowców.

Modyfikacje kowalencyjne
Jest to proces, w którym chemicznie reaktywne składniki zostają dołączone kowalencyjnie do reaktywnego łańcucha bocznego aminokwasów z enzymu. Zaobserwowano znaczną stabilizację dzięki zastosowaniu kowalencyjnych modyfikatorów takich jak: węglowodany, lipidy, podstawniki alkilowe i aromatyczne. Technikę tę zastosowano do stabilizacji α-amylazy, lizosomu, rybonukleaz i lipaz. Przykładem może być zastosowanie aldehydu glutarowego do stabilizacji amylazy.

Kowalencyjna immobilizacja z sieciowaniem
W tej modyfikacji enzym jest unieruchomiony na powierzchni polimerów kowalencyjnie lub poprzez interakcje fizyczne. Technika zaowocowała imponującym wzrostem stabilności enzymu. Na przykład trypsyna unieruchomiona na glikolu polietylenowym jest 1000 razy bardziej stabilna niż w przypadku rozpuszczalnej formy a unieruchomiona lipaza 140 razy bardziej stabilna w stosunku do formy niezwiązanej.

Niekowalencyjne kompleksy białko-białko
Przykładem rezultatów takiego podejścia może być zwiększenie termostabilności subtilizyny, która wzrosła o 20°C poprzez stworzenie kompleksu z jego inhibitorem (również cząsteczką białka). Wzmocniona termostabilność została spowodowana zwiększeniem oddziaływań hydrofobowych.

Wiązanie przeciwciał
W lizozymie interakcja z przeciwciałem spowodowała powstanie trzech mostków solnych, 10 wiązań wodorowych oraz 74 Van der Waalsa - oddziaływań mających na celu jego termostablizację. Odporność na wyższą temperaturę również została znacznie zwiększona przez takie podejście w α-amylazie, glucoamylazie i subtilizynie.

Zastosowanie rozpuszczalników organicznych
Reakcje enzymatyczne w rozpuszczalnikach organicznych owocują zmniejszeniem tempa wzrostu drobnoustrojów, zwiększeniem termostabilności, zwiększeniem specyficzności substratowej i przesunięciem równowagi reakcji. Zwykle enzymy nie funkcjonują w rozpuszczalnikach organicznych. Badania udowodniły, iż enzymy ekstremofili mogą funkcjonować bez zakłóceń w różnych rozpuszczalnikach organicznych i są termicznie stabilne. Enzymy izolowane od halofili i mezofili były liofilizowane w obecności wysokiej koncentracji soli a następnie, w postaci proszku, zostały dodane do rozpuszczalników organicznych, gdzie wykazały znaczną aktywność. Sól odwadnia enzymy przyklejając się do nich, w ten sposób chroniąc je przed wodą. Wystarczająca jej ilość jest obecna po to, aby zachować odpowiedni ładunek cząsteczki w miejscu aktywnym oraz prawidłową konformację enzymu. Przy katalizie w rozpuszczalnikach organicznych zauważono także wzrost termostabilności, ze względu na sztywny charakter enzymów. Niektóre przemysłowo ważne enzymy jak lipazy, proteazy, lizosomy i rybonukleazy również przystosowano do funkcjonowania w różnych rozpuszczalnikach organicznych.


Enzymy ekstremofili wykorzystywane w biotechnologii


Zastosowanie enzymów termofili
Termofilne ektremofile przyciągają największą uwagę przemysłu. W szczególności są to ekstremofilne proteazy i lipazy enzymów rozkładających polimery, takich jak celulazy, chitynazy i α-amylazy. Powody do wykorzystania enzymów które są stabilne i aktywne w podwyższonych temperaturach są oczywiste. W tych warunkach rozpuszczalność składników wielu reakcji, w szczególności polimerowych, znacznie się poprawa. Ponadto ryzyko kontaminacji, prowadzące do niepożądanych powikłań w trakcie procesu, w wyższych temperaturach jest ograniczone. Cechy strukturalne ciepłolubnych enzymów ekstremofili są interesujące. Zostało zbadanych kilka trójwymiarowych struktur, które następnie porównano z odpowiednikami pochodzącymi z mezofili, w celu wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw termostabilności. W tym celu zastosowano strukturalny alligment i modelowanie homologii. Dla tej klasy enzymów stwierdzono, że została ona osiągnięta poprzez zwiększenie ładunku powierzchniowego, wzrost hydrofobowości rdzenia białka i zastąpienie obecnych na powierzchni termolabilnych aminokwasów.

Zastosowanie enzymów psychrofili
Enzymy pochodzące z psychrofili stały się ciekawym zagadnieniem dla przemysłu głównie z powodu trwających wysiłków na rzecz zmniejszenia zużycia energii. Istnieje rosnąca chęć zastosowania enzymów psychrofilnych w detergentach. Dzięki nim realne staje się rozwój środków piorących, które mogłyby być stosowane w niższych temperaturach, aż do temperatury wody wodociągowej, czyli około 8°C, co spowodowałoby niewyobrażalne oszczędności energii elektrycznej. Takie nowoczesne środki piorące są przedmiotem zainteresowania największych koncernów chemicznych produkujących chemię gospodarczą. Zastosowanie w tych procesach mają znaleźć α-amylazy, proteazy i lipazy pochodzące z psychrofili. Również przemysł celulozowo-papierniczy jest zainteresowany enzymami rozkładającymi polimery, które są aktywne w niższych temperaturach. Podobnie jest z produkcją żywności gdzie stosuje się enzymy tej grupy ektremofili do jej przetwarzania. Cechą charakterystyczną wielu biokatalizatorów z tych gatunków jest korelacja wysokiej działalności katalitycznej i niskiej stabilności termicznej w umiarkowanej temperaturze, która może być częściowo wytłumaczona większą elastycznością cząsteczki, w porównaniu z enzymami ciepłolubnych "kuzynów". Zakłada się, że większa elastyczność jest skorelowana ze zmniejszającą się stabilnością i rzeczywiście często obserwuje się delikatną równowagę pomiędzy stabilnością i aktywnością. Niemniej jednak istnieje coraz większa liczba przykładów z natury, a także tych uzyskanych z pomocą inżynierii białek, które wykazują, że funkcje strukturalne zaangażowane w stabilność lub aktywność mogą być bardzo różne i działać niezależnie.

Zastosowanie enzymów halofili
Halofile mogą przetrwać w środowisku o wysokim stężeniu soli dzięki ich zdolność do utrzymania równowagi osmotycznej. Akumulują chlorek sodu lub potasu do stężenia, które jest izotoniczne z otoczeniem. W rezultacie ich białka muszą poradzić sobie z bardzo wysokim stężeniem soli (np. KCl stężenia 4 M i stężenia NaCl > 5 M). Enzymy przystosowały się do tej presji ze strony środowiska, poprzez nabycie stosunkowo dużej liczby ujemnie naładowane aminokwasów, które są obecne na ich powierzchni, w celu uniknięcia precypitacji. W związku z tym w ośrodkach o niższych stężeniach soli rozpuszczalność halofilnych enzymów jest często bardzo słaba i może ograniczyć ich stosowanie. Ta właściwość została zastosowana w wykorzystaniu tych enzymów w roztworach zarówno wodnych, bezwodnych i organicznych. Na przykład zewnątrzkomórkowa proteaza z Halobacterium halobium została wykorzystana do efektywnej syntezy peptydów. Fosfatazy są używane w roztworach organicznych przy bardzo niskich stężeniach soli do trappingu enzymu w odwrócone micele. Podobne obserwacje były prowadzone z wykorzystaniem dehydrogenazy jabłczanowej. Zastosowanie odwróconych miceli, w połączeniu z biokatalizatorami halofilnymi jest techniką mogącą prowadzić do rozwoju nowych zastosowań dla tych enzymów.

Zastosowanie enzymów alkalofili i acidofili
Enzymy z mikroorganizmów które mogą przetrwać w skrajnych wartościach pH mogą być szczególnie użyteczne w przypadku aplikacji w warunkach wysoce kwaśnych lub wysoce alkalicznych reakcji, na przykład w produkcji detergentów. Jednym z uderzających właściwości kwasolubnych i alkalofilnych mikroorganizmów jest ich zdolność do utrzymania neutralnego pH wewnątrz komórki, co powoduje iż enzymy wewnątrzkomórkowe tych mikroorganizmów nie muszą być dostosowywane w szczególny sposób do warunków ekstremalnego wzrostu. Podejście to nie uwzględnia jednak zewnątrzkomórkowych białek, które mogą funkcjonować w niskich lub wysokich pH środowiska, dzięki swoim specyficznym przystosowaniom. Α-amylazy, lipazy, proteazy i inne enzymy, które są odporne i aktywne w wysokim stężeniu jonów powodujących kwasowość lub zasadowość środowiska oraz licznej obecności chelatorów, są pożądanymi surowcami do zastosowań w produkcji nowoczesnych detergentów. Skłoniło to do badań mających na celu zidentyfikowanie właściwości mających wpływ na produkcji takich enzymów. Do wykrywania alkalicznych proteaz zastosowano kombinacje technik PCR i aktywnego screeningu. Alkalofilne laseczki, które mogą rosnąć w pH ˃ 9, wykorzystane zostały jako źródło do otrzymania żaroodpornych proteaz alkalicznych, natomiast hydroliza polimerów pozwoliła wszcząć poszukiwania biokatalizatorów pochodzących z acidofilów. Dzięki tym przedsięwzięciom wyizolowano wiele enzymów, używanych do hydrolizy skrobi, np. α-amylazy, pulanazy, glukoamylazy i glucozydazy, które są aktywne w niskim pH.

Zastosowanie enzymów piezofili (bazofili)
Uważa się, że ciśnienie nie jest selektywne w odniesieniu do funkcji białka. To założenie opiera się na konkluzji, iż jest potrzebna wartość powyżej 400 MPa, aby wywołać denaturacje białek pojedynczego łańcucha. Należy zauważyć, że nawet mikroorganizmy które żyją w głębokich warstwach morza nie są narażone na naciski, które przekraczają 120 MPa, toteż nie potrzeba im specjalnych mechanizmów przystosowawczych związanych z obecnością wysokiego ciśnienia. Mimo tego, istnieją przykłady konkretnych stabilizacji białek w jego obecności. Enzymy z piezofili mogą być stosowane, w szczególności do produkcji, gdzie są one stosowane do przetwarzania i sterylizacji żywności i materiałów.

Wykorzystanie enzymów innych ekstremofili
Jako ważniejsze należy wspomnieć wykorzystanie metalotolerantów do eliminacji toksycznych kationów, lub odzyskiwania cennych pierwiastków z zanieczyszczonej wody i gleby metodami biotechnologicznymi, przy pomocy żywej lub martwej biomasy drobnoustrojów, natomiast ektremofile radioodporne można wykorzystywać do utylizacji radioaktywnych odpadów, (elektrownie atomowe, kopalnie rud uranu), biodegradacji toksycznych związków organicznych, (np. toluen, chlorobenzen, indol). Trwają też starania nad rozpoczęciem badań podstawowych z zakresu mechanizmów naprawczych ich komórek, które mogłyby znaleźć zastosowanie w powstrzymywaniu rozwoju nowotworów.


Przemysłowe zastosowania enzymów pochodzących z konkretnych grup ektremofili zostały podsumowane i umieszczone w poniższej tabeli.


 

Typ bakterii

Charakterystyka wzrostu

Enzym

Zastosowanie

 

 

 

 

 

 

termofile

 

 

 

 

temperatura > 80°C (hipertermofile)

temperatura 60-80 °C (termofile)

proteazy

detergenty, produkcja żywności i pasz, produkcja piwa, piekarnictwo

hydrolazy glukozylowe (amylazy, pulanazy, glukoamylazy, glikozydazy, celulazy)

przetwarzanie skrobi celulozy i hityny

chitynazy

modyfikacje chityny w produkcji żywności i przemyśle farmaceutycznym

ksylanazy

wybielanie papieru

lipazy, esterazy

detergenty, reakcje stereospecyficzne

polimerazy DNA

biologia molekularna np. reakcje PCR

dehydrogenazy

reakcje utleniania

 

 

 

psychrofile

temperatura < 15°C

 proteazy

detergenty produkcja żywności

amylazy

detergenty, piekarnictwo

celulazy 

detergenty, pasze, tekstylia

dehydrogenazy

biosensory

lipazy

detergenty, produkcja paszy i kosmetyków

 

halofile

wysokie stężenie soli

( np. 2-5 M NaCl)

proteazy

synteza peptydów

dehydrogenazy

biokataliza w mediach organicznych

alkalofile

 pH > 9

proteazy, celulazy

detergenty, produkcja żywności i pasz

acidofile

 pH < 2-3

proteazy, celulazy

składniki paszowe

amylazy, glukoamylazy

przetwarzanie skrobi

oksydazy

odsiarczanie węgla

piezofile

wysokie cisnienia aż do 130 MPa

 różne

produkcja żywności i antybiotyków


Tabela 1. Enzymy ekstremofili stosowane w różnych dziedzinach przemysłu.


Literatura:
1. Van den Burg B. (2003) : Extremophiles as a source for novel enzymes. Current Opinion in Microbiology., 6, 213-218.
2. http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Leki_Biochemia/dydaktyka/biologia_komorki/porownanie_metod_dezintegracji_komorek.pdf.
3. Karan R., Capes M., DasSarma S., (2012) : Function and biotechnology of extremophilic enzymes in low water activity. Aquatic Biosystems,. 8:4.
4. Kumar S., (1998) : Enzyme Vs. Extremozyme What Makes Extremozymes Function Under Harsh Conditions?. Resonance. Journal of science education., 3, 32-40.
5. Sawle L., Ghosh K. (2011) : How Do Thermophilic Proteins and Proteomes Withstand High Temperature? Biophysical Journal., 101, 217–227.
6. Das R., Gerstein M. (2000) : The stability of thermophilic proteins: a study based on comprehensive genome comparison. Funct Integr Genomics., 1, 76-88.
7. Niehaus F., Bertoldo C., KaÈhler M., Antranikian G., (1999) : Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application., Appl Microbiol Biotechnol., 51., 711-729.


Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

62 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u