Fermentacja cytrynowa polega na wytwarzaniu kwasu cytrynowego z glukozy przy wykorzystaniu odpowiednich pleśni. Sumarycznie równanie reakcji prezentujące przebieg fermentacji przedstawić można za pomocą schematu:
3C6H12O6 + 9O2 + Aspergillus niger => 2C6H8O7 + 6CO2 + 10H2O + kcal
Kwas cytrynowy
Kwas cytrynowy (2-hydroksy-1,2,3-propanotrikarboksylowy) jest jednym z najważniejszych produktów otrzymywany na drodze biotechnologicznej. W formie krystalicznej kwas ten występuje w postaci bezwodnej lub jednowodnej. Jednowodna forma powstaje na drodze krystalizacji w temperaturze poniżej 36,6ºC, powyżej tej temperatury powstaje forma bezwodna. Kwas cytrynowy występuje w przyrodzie w owocach cytrusowych i ananasach. Owoce te do niedawna były głównym źródłem tego kwasu. Światowa produkcja kwasu cytrynowego przekracza 300 000 ton rocznie. Jego wykorzystanie wynika m.in. z działania konserwującego na skutek obniżania wartości pH środowiska. Jednocześnie jest związkiem nietoksycznym, o dobrych walorach smakowych i zapachowych.
Metody produkcji kwasu cytrynowego
Produkcję kwasu cytrynowego prowadzić można kilkoma metodami:
• powierzchniowa (statyczna),
• wgłębna (dynamiczna),
• na pożywkach stałych.
Metoda powierzchniowa (wydajność procesu 70– 80 %)
W metodzie powierzchniowej w warunkach statycznych grzybnia Aspergillus niger rozwija się na powierzchni pożywki, tworząc gęstą plechę złożoną z mocno rozgałęzionych strzępek. W metodzie tej najczęściej stosowanym surowcem jest melasa buraczana. Sterylną pożywkę melasową rozlewa się do płytkich tac fermentacyjnych sporządzonych ze stali kwasoodpornej i umieszcza się w komorach z regulacją temperatury i napowietrzania. Kiedy temperatura pożywki obniży się do wartości 40°C, szczepi się ją zarodnikami pleśni zmieszanymi z węglem aktywnym jako nośnikiem. Po 24 godzinnej inkubacji pojawia się widoczna cienka grzybnia, której intensywny wzrost trwa do 48-72 godz., po czym słabnie na korzyść produkcji kwasu cytrynowego. Dojrzała grzybnia osiąga grubość 2-3 cm. Jej warstwa dolna stykająca się z podłożem jest odpowiedzialna za syntezę kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu fermentacji wynosi 7-9 dni w temp. 30°C-34°C, wydajność procesu 70-80%. Podczas fermentacji obok kwasu cytrynowego (80%), do podłoża wydzielany jest kwas szczawiowy i kwas glukonowy oraz w śladowych ilościach kwasy z cyklu Krebsa. Po zlaniu spod grzybni przefermentowanego podłoża można ponownie wprowadzić świeżą pożywkę i wykorzystywać grzybnię kilkukrotnie. Materiał odpadowy jakim jest grzybnia pleśni (ok. 10 kg/1 m2 tac) może być wykorzystana jako źródło białka (ok. 20%).
Metoda wgłębna (wydajność procesu 80-90%)
Wgłębna metoda biosyntezy kwasu cytrynowego w skali przemysłowej prowadzona jest w bioreaktorach o poj. 50-100 m3 z użyciem surowców o wyższym stopniu czystości niż w metodzie powierzchniowej, tj. cukru handlowego (sacharoza), soków cukrowniczych, mączek cukrowych, hydrolizatów skrobiowych. Rzadziej stosuje się melasę, ponieważ proces wgłębny z jej użyciem nie zapewnia odpowiedniej wydajności kwasu cytrynowego. W metodzie wgłębnej, w wyniku ciągłego mieszania, grzybnia rozwija się w całej objętości podłoża. Po 48 godzinach rozpoczyna się faza produkcji kwasu cytrynowego. Czas trwania procesu biosyntezy, do momentu wyczerpania źródła węgla, wynosi od 5 do 7 dni w temperaturze 30-32°C.
Zalety metody wgłębnej w porównaniu do powierzchniowej:
• krótszy czas trwania procesu,
• mniejsze zagrożenie rozwojem obcej mikroflory z uwagi na niskie pH i zamknięte bioreaktory,
• możliwość wydzielania kwasu cytrynowego z pożywki na drodze krystalizacji,
• mniejsze obciążenie ściekami.
Różnice miedzy metodą powierzchniową a wgłębną:
W hodowli powierzchniowej obydwie fazy przebiegają w systemie jednostopniowym. W procesie wgłębnym pierwsza faza odbywa się w podłożu inokulacyjnym, o składzie różniącym się od fermentacyjnego, głównie ze względu na zmniejszoną ilość źródła węgla.
Na pożywkach stałych (wydajność procesu 20%)
Metoda ta najpowszechniej rozwinęła się w Japonii. Surowcem w tej metodzie mogą być odpady przemysłu ziemniaczanego i młynarskiego np. otręby, a także wytłoki z trzciny cukrowej, wadliwa melasa buraczana czy trzcinowa, która z uwagi na niewłaściwy skład, nie mogła być wykorzystana w pozostałych metodach. Proces fermentacji prowadzi się w fermentorach tacowych (wilgotność podłoża 65-70%) w napowietrzonych komorach przez ok. 90 godz. Kwas wydziela się z podłoża poprzez ekstrakcję wodą. Metoda ta ma znaczenie marginalne, chociaż budzi też duże nadzieje ze względu na znacznie niższe obciążenie produkcji ściekami oraz wyższą tolerancję A. niger na obecność jonów metali i mikroelementów.
Mikroorganizmy fermentacji cytrynowej
• szczepy pleśni Aspergillus niger, Aspergillus wentii, Pencillium luteum, Trichoderma viridae,
• drożdze z rodzaju Candida (Candida lipolytica, Candida tropicalis, Candida intermedia), które syntetyzują kwas cytrynowy w obecności n-alkanów,
• bakterie z rodzaju Arthrobacter.
Surowce do produkcji kwasu cytrynowego
Podłoże hodowlane odgrywa niezwykle istotną rolę w produkcji kwasu cytrynowego:
• źródłem węgla i energii są cukry (stężenie zwykle 10-22%, tj. ~ 10% dla hodowli wgłębnej, 16% dla hodowli powierzchniowej – melasa buraczana, syropy glukozowy lub fruktozowy),
• kwasowość pożywki musi być wysoka (pH 2-3) – w tych warunkach kwas cytrynowy jest głównym produktem fermentacji; przy wyższych wartościach pH wytwarzane są znaczne ilości kwasu szczawiowego i glukonowego,
• istotne jest wyeliminowanie soli metali (żelaza, manganu, cynku, etc.) – w tym celu dodaje się do podłoża żelazocyjanek potasu, który wytrąca jony metali, natomiast w nadmiarze działa jako inhibitor wzrostu i promotor wytwarzania kwasu,
• niskie stężenie soli fosforowych i amonowych (zwykle siarczan amonu – źródło azotu) co limituje wzrost grzybni,
• podłoże musi być intensywnie napowietrzane.
Zastosowanie kwasu cytrynowego
Przemysł spożywczy:
• przemysł owocowo-warzywnym, kwas cytrynowy służy jako inaktywator enzymów (oksydaz), które odpowiedzialne są za utlenianie związków fenolowych, powodujących ciemnienie owoców i warzyw,
• w produkcji win, jako preparat zakwaszający i stabilizujący,
• antyoksydant olejów, wiążąc jony metali (Fe, Cu, Zn) katalizujące proces jełczenia tłuszczów staje się stabilizatorem,
• stabilizacji barwy, smaku i zapachu ryb, krewetek, owoców i warzyw składowanych w chłodniach.
Przemysł farmaceutyczny:
• jako dodatek do tabletek, z kwaśnym węglowodanem sodu powoduje musujący efekt podczas rozpuszczania w wodzie,
• jako preparat zapobiegający krzepnięciu krwi, używany w Stacjach Krwiodawstwa,
• przy zatruciach ołowiem, kwas cytrynowy reagując z tym pierwiastkiem przekształca go w połączenia trudno przyswajalne przez organizm.
Przemysł kosmetyczny:
• wchodzi w skład kosmetyków np. szamponów, toników, kremów, utrwalaczy do włosów.
Przemysł tekstylny:
• stosowany przy wyrobie tkanin – nadaje im trwałość i niepodatność na gniecenie.
Karolina Bombolewska
Literatura:
1. Schlegel H., 2003. Mikrobiologia Ogólna. Wydawnictwo Naukowe PWN.
2. Kunicki-Goldfinger W., 1998. Życie bakterii. Wydawnictwo Naukowe PWN.
3. Błaszczyk M., 2009. Mikroorganizmy w ochronie środowiska. Wydawnictwo Naukowe PWN.
