PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Fragment skryptu: Biologia molekularna roślin
Uniwersytet Warszawski (www)
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN (www)
Zakład Biologii Molekularnej Roślin (www)
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski
Adres:
ul. Pawińskiego 5a,
02-106 Warszawa
Kontakt: tel. (+48 22) 592 5704,
E-mail: andyj@ibb.waw.pl
Zakład Biologii Molekularnej Roślin
Problematyka badawcza: Rola struktury chromatyny w regulacji rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na czynniki stresowe i hormonalne. Prowadzone aktualnie badania mają na celu poznanie funkcji roślinnych kompleksów remodelujących chromatynę, histonu H1 i modyfikacji potranslacyjnych histonów rdzeniowych, a także opisanie proteomu jądrowego rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.
Stosowane techniki: Większość metod biologii molekularnej, metody biochemii białek, analiza proteomiczna (mass-spec) i transkryptomiczna (mikromacierze), genetyka Arabidopsis thaliana (konstrukcja i analiza mutantów), metody bioinformatyczne.
_______________________________________________________________________________
Celem ćwiczenia jest porównanie poziomu fosforylacji histonu H3 w komórkach tytoniu (TBY-2) dzielących się i komórkach zatrzymanych w fazie G0 cyklu komórkowego. Przejście zawiesiny do G0 uzyskuje się w przypadku komórek TBY-2 poprzez 30-krotne obniżenie zawartości sacharozy w pożywce.
Schemat doświadczenia:
- Izolacja białek histonowych z komórek tytoniu (BY-2).
– Ocena ilości wyizolowanych białek za pomocą SDS-PAGE.
– Rozdział elektroforetyczny wyizolowanych białek i transfer na membranę PVDF metodą pół-suchą.
– Detekcja fosforylowanego histonu H3 za pomocą specyficznych przeciwciał.
- Uwidocznienie związanych przeciwciał metodą ECL.
- Analiza densytomatryczna ilości wykrytego białka.
Dzień 1.
Izolacja białek z materiału roślinnego
Metody stosowane przy izolacji i oczyszczaniu białek zależą od właściwości danego białka. Poniżej, podano procedurę izolacji histonów rdzeniowych. Należy jednak pamiętać, że obok histonów metodą tą ekstrahuje się również wiele innych białek.
Materiały:
– zamrożony materiał biologiczny (komórki hodowane w pożywce MS z 0,1% i 3% sacharozą),
– ciekły azot,
– lód,
– probówki wirówkowe na 30 ml lub falkony 50 ml,
– duża wirówka z chłodzeniem,
– kołyska laboratoryjna,
– moździerze i tłuczki,
– homogenizator,
– włóknina „Miracloth” lub gaza,
– suszarka (zimny strumień powietrza),
– waga laboratoryjna.
Odczynniki:
– 2M Tris-HCl pH 7,8,
– 0,5M EDTA pH 8.0,
– 36-38% HCl (11,46M),
– 2-merkaptoetanol (14,2 M),
– 100 mM PMSF,
– 100% TCA,
– 5x SDS loading buffer (60 mM Tris-Cl pH 6.8, 2% SDS, 10% glicerol, 0.025% Bromophenol Blue),
– 1 M DTT,
– zimny aceton (-20°C),
– bufor HI (Histone Isolation): 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 2 mM EDTA; 0,25 M HCl; 5 mM 2-merkaptoetanol*; 0,2 mM PMSF * (* dodać nie wcześniej niż 30 min. przed izolacją).
W trakcie izolacji nie należy ogrzewać materiału, trzeba dbać o utrzymanie niskiej temperatury poprzez trzymanie próbek w lodzie lub pracę w chłodni. Wszelkie wirowania należy przeprowadzać w schłodzonej do 4°C wirówce. Pierwszym etapem homogenizacja komórek w celu uwolnienia białek. Następnie białka wytrącane są kwasem trójchlorooctowym (TCA). TCA usuwany jest z osadu białek poprzez płukanie zmrożonym acetonem.
Wykonanie
1. 0,1 – 1 g materiału roślinnego zamrozić w ciekłym azocie i utrzeć w moździerzu porcelanowym na proszek (zarówno moździerz jak i tłuczek należy wcześniej schłodzić poprzez zalanie ciekłym azotem; ucieranie komórek z zawiesiny będzie łatwiejsze, jeżeli przed odwinięciem foli „obstukamy” ją zimnym tłuczkiem). Nie dopuścić do rozmrożenia.
2. Proszek przenieść schłodzoną szpatułką do falkonu na 50 ml zawierającego 10 ml buforu HI (tuż przed izolacją dodać do buforu HI 2-merkaptoetanol i PMSF).
3. Zawiesinę dodatkowo homogenizować ok. 20 s homogenizatorem przy najwyższych obrotach (należy pamiętać, że nóż homogenizatora trzeba dobrze opłukać przed i po homogenizacji (najlepiej trzymając pracujący nóż w plastikowej butelce z wodą destylowaną) i wytrzeć do sucha papierowym ręcznikiem; pracujące noże należy trzymać w roztworze).
4. Próbki zrównoważyć i wirować przez 15 minut przy 12000 g w plastikowych probówkach 30 ml.
5. Supernatant przelać do falkonu na 50 ml przez warstwę Miracloth lub wielokrotnie złożoną gazę.
6. Dodać 100% TCA do końcowego stężenia 20 do 25%. Uwaga: TCA jest substancją silnie żrącą, dodawać w rękawiczkach pod włączonym wyciągiem. Po pracy z TCA rękawice wyrzucić i założyć nowe.
7. Pozostawić w lodzie na co najmniej 30 minut na kołysce laboratoryjnej.
8. Po zrównoważeniu prób zwirować przez 30 – 40 minut przy 16 000 g w szklanych 30ml probówkach Corex (należy pamiętać o założeniu gumowych adaptorów na próbówki).
9. Wylać supernatant, zaznaczyć położenie osadu w probówce pisakiem wodoodpornym.
10. Przepłukać osad dwukrotnie porcjami po 10 ml zimnego (-20°C) acetonu, po obu płukaniach zwirować w warunkach podanych wyżej przez 5 min. Należy pamiętać o zrównoważeniu próbek i umieszczeniu probówek tak, aby osad znajdował się na zewnątrz od osi rotora.
11. Osad wysuszyć strumieniem zimnego powietrza trzymając probówkę w lodzie Uwaga: Na tym etapie można przerwać doświadczenie, probówki z wysuszonym osadem można przechowywać w -20°C.
12. Zawiesić w 300 μl 1x SDS loading buffer, przenieść do 1,5 ml probówek typu eppendorf i dodać po 15 µl 1M DTT.
13. W celu usunięcia nierozpuszczalnego osadu zwirować w mikrowirówce w 4°C przez 15 minut i przenieść do świeżych probówek. Tak uzyskane preparaty białkowe przechowywać w –20°C.
Dzień 2 i 3.
Elektroforeza SDS-PAGE
Dla sprawdzenia wydajności i oszacowania ilości białek wyizolowanych podczas ćwiczeń wystarczy żel 12%. Rozdział białek w takim żelu zachodzi szybciej. Do analizy Western Blot lepszy będzie żel 15% (lepsza rozdzielczość dla białek histonowych). Czas doświadczenia około 3 h, barwienie przez całą noc.
Przygotowanie żelu do SDS PAGE:
Materiały:
– 2 przekładki (spacers) grubości 1 mm,
– szklana płytka,
– porcelanowa płytka,
– caster clamp,
– caster,
– 2 czarne śruby,
– 2 czerwone klipsy,
– grzebień o grubości 1 mm,
– kalka ze wzorem studzienek,
– bibuła filtracyjna,
– aparat do elektroforezy,
– zasilacz.
Odczynniki:
– mieszanina monomerów (30% akrylamid, 0.8% bisakrylamid),
– 1.5 M Tris-Cl pH 8.8,
– 0.5 M Tris-Cl pH 6.8,
– 10% SDS,
– woda destylowana,
– 10% APS,
– TEMED,
– butanol nasycony wodą,
– bufor SDS-PAGE (25 mM Tris, 192 mM glicyna, 0.1% SDS pH 8.3),
– roztwór utrwalający (7% kwas octowy, 40% metanol),
– roztwór barwiący: (0,025% Coomassie Brillant Blue G-250 w 10% kwasie octowym),
– roztwór odbarwiający (10% kwas octowy, 25% metanol),
– komercyjny ekstrakt histonów rdzeniowych,
– standard (marker) wielkości białek.
Wykonanie
<img src=”http://e-biotechnologia.pl/obrazki/przekladki.JPG” ALIGN=”left” alt=”elektroforeza białek” HSPACE=10 VSPACE=10/> 1. Przetrzyj szklane szybki i ceramiczne płytki metanolem lub acetonem.
2. Włóż po bokach – pomiędzy szybkę a płytkę przekładki (Rys.2. przekładka pomiędzy szybkami) i umieść w statywie casting clamp (Rys.3.). Wcześniej należy upewnić się, że na statywie nie zostały resztki zaschniętego akrylamidu.
3. Dokręć śruby aż poczujesz lekki opór (zbyt mocne dociśnięcie może spowodować pęknięcie szybki).
4.Wstaw do podstawki (casting cradle) i dociśnij do silikonowej gumy w podstawie poprzez przekręcenie do góry czarnych śrub. W celu sprawdzenia szczelności układu można między szybki wlać wodę destylowaną. Po takim teście szyby należy dokładnie osuszyć bibułą.
<img src=”http://e-biotechnologia.pl/obrazki/casting_clamp.JPG” ALIGN=”right” alt=”elektroforeza białek” HSPACE=10 VSPACE=10/> 5. Przygotuj mieszaninę dla żelu rozdzielającego:
12% żel rozdzielający:
– 3 ml mieszaniny monomerów (30% akrylamid,0,8% bisakrylamid); (3,75 ml dla 15%)
– 1,8 ml 1.5M Tris-Cl pH 8.8,
– 75 μl 10% SDS,
– 2,625 ml wody; (1,88ml dla 15%),
– 75 μl 10% APS,
– 7,5 μl TEMED,
– APS i TEMED dodaje się tuż przed wylaniem mieszaniny pomiędzy szyby.
6. Od razu po dodaniu katalizatorów polimeryzacji roztwór dokładnie, ale delikatnie wymieszaj (unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza) i wlej pomiędzy przygotowane szybki pozostawiając 3-4 cm na żel rozdzielający.
7. Nałóż warstwę (2-3 mm) nasyconego wodą butanolu i pozostaw do polimeryzacji na co najmniej 30 min.
8. Delikatnie usuń butanol i osusz bibułą szybki.
9. Wlej żel zatężający i włóż grzebień pomiędzy szybki. Grzebień trzeba umieścić tak, by w studzienkach nie było pęcherzyków powietrza. Żel jest gotowy do użycia po 20- 30 minutach.
Żel zatężający:
– 0,65 ml mieszaniny monomerów,
– 1.2 ml 0.5M Tris-Cl pH 6.8,
– 120 μl 10% SDS,
– 3 ml wody,
– 150 μl 10% APS,
– 15 μl TEMED.
Tak przygotowany żel można zapakować szczelnie w folię z kawałkiem mokrego ręcznika papierowego i przechowywać kilka dni w lodówce.
10. Przed elektroforezą żel (wraz z szybami) umieszcza się w aparacie, przymocowując czerwonymi klipsami (Rys. 4) i zalewa buforem elektrodowym (bufor SDS PAGE). Uwaga! przygotowany bufor jest 5 razy stężony.
11. Po ostrożnym wyjęciu grzebienia z żelu nie można zapomnieć o przepłukaniu studzienek i usunięciu ewentualnych pęcherzy powietrza spomiędzy szyb w dolnej części żelu.
Przygotowanie próbek do naniesienia na żel
Uwaga: nie dotyczy standardu wielkości
12. Do podpisanych probówek odpipetować po 10 i 20 μl każdej próbki. Dodatkowo marker wielkości białek (Rys. 5) – 3 μl oraz komercyjną mieszaninę histonów rdzeniowych 5 μl.
<img src=”http://e-biotechnologia.pl/obrazki/marker_wielkosci.JPG” ALIGN=”left” alt=”elektroforeza białek” HSPACE=10 VSPACE=10/> 13. Inkubować preparaty przez 8-10 minut w 95°C – denaturacja białek (za wyjątkiem standardu wielkości).
14. Krótko zwirować w mikrowirówce.
15. Nanieść próbki na żel za pomocą wydłużonych tipsów i rozpocząć elektroforezę.
Elektroforeza
Natężenie i napięcie, przy których prowadzona jest elektroforeza, są zależne od grubości, szerokości i długości żelu oraz naszych oczekiwań co do jakości i czasu rozdziału białek. Zwykle zalecane jest stałe natężenie prądu w granicach 12 – 30 mA / żel grubości 1 mm i szerokości 10 cm. Należy ustawić natężenie prądu 25 mA na 1 żel. 12% żel rozwijać do czasu aż czoło barwnika będzie wychodzić z żelu. W przypadku żelu 15% dobrze jest wydłużyć elektroforezę o ok. 10 minut. Przy doborze parametrów elektroforezy dla innej wielkości żeli należy pamiętać, że wraz ze wzrostem szerokości i grubości żelu można zwiększyć natężenie prądu. Jeśli żel jest dłuższy należy zwiększyć napięcie. Przy doborze napięcia i natężenia prądu należy zwrócić uwagę na moc prądu, który będzie płynął przez żel (natężenie * napięcie). Parametr ten mówi ile ciepła będzie wydzielało się podczas elektreoforezy.
Barwienie białek w żelu
Spośród wielu metod barwienia białek po SDS-PAGE wybrano najpowszechniej stosowaną metodę barwienia Coomassie Brillant Blue. Histony są białkami wysoce zasadowymi. W związku z tym ich migracja w żelu SDS jest zaburzona, tzn. położenie prążków nie odzwierciedla prawdziwej wielkości białek.
<img src=”http://e-biotechnologia.pl/obrazki/masy_czasteczkowe_histonow.JPG” ALIGN=”right” alt=”masy cząsteczkowe histonów” HSPACE=10 VSPACE=10/> Wykonanie
1. Po zakończeniu elektroforezy należy rozmontować aparat i delikatnie rozdzielić szyby.
2. Żel umieścić w roztworze utrwalającym i zostawić na kołysce laboratoryjnej na 15- 30 minut.
3. Następnie usunąć utrwalacz i zalać roztworem barwiącym. Barwić do uzyskania wyraźnych prążków – pozostawienie żelu na dłużej w roztworze utrwalającym (np. na noc) przyspiesza barwienie białek.
4. Po zabarwieniu żel inkubować w roztworze odbarwiającym do uzyskania prawie przezroczystego tła i wyraźnych prążków białek, od kilku do kilkudziesięciu minut. Żel po odbarwieniu może być długo przechowywany w roztworze 7% kwasu octowego.
5. Oszacować ilości białka w żelu tak, aby w badanych próbach mieć zbliżone ilości histonów rdzeniowych. Ilości można oszacować „na oko”, co bywa zawodne lub zeskanować wybarwiony żel białkowy i oszacować ilości za pomocą programu komputerowego np. ImageJ. Należy pamiętać o tym, że jakość rozdziału w SDS-PAGE zależy od poprawnego i solidnego wykonania szeregu prostych czynności. Dlatego też, mimo iż technika nie jest skomplikowana, może zajmować sporo czasu, kilkakrotnie więcej niż elektroforeza w żelach agarozowych służąca do rozdziału preparatów DNA. Ewentualna dodatkowa elektroforeza (lub kilka), może okazać się niezbędna, do ustawienia równych ilości białka. Przed przejściem do kolejnych etapów doświadczenia, ilość białek we wszystkich analizowanych próbach powinna być taka sama – wystandaryzowana.
Dzień 4.
Western blot
W trakcie ćwiczeń wykorzystamy niewyznakowane przeciwciała pierwszorzędowe rozpoznające histon H3 z ufosforylowaną seryną 10 i drugorzędowe sprzężone z peroksydazą z chrzanu.
Materiały:
– nie barwiony żel poliakrylamidowy z rozdzielonymi białkami (może być przechowywany przez noc w 4°C, zabezpieczony wilgotną bibułą i folią),
– membrana Westran,
– bibuła Whatman,
– transblotter,
– zasilacz,
– kołyska laboratoryjna,
– mysie przeciwciała pierwszorzędowe antyfosfo(ser10)-histon H3 rozcieńczone w buforze TBST 1:5 000 z w 5% mleku w azydku sodu.
Odczynniki:
– bufor TGM: 25 mM Tris, 192 mM glicyna, 20% methanol.
– TBST: 20 mM TrisHCl pH 8.0, 165 mM NaCl, 0.2 % Tween
– odtłuszczone mleko w proszku,
– mysie przeciwciała pierwszorzędowe (antyfosfo (ser10)- histon H3),
– przeciwciała drugorzędowe (anty-mysie sprzężone z peroksydazą z chrzanu),
– 1M Tris-HCl pH 8,
– 250 mM luminol rozpuszczony w DMSO (Dimetylosulfotlenek),
– 90 mM kwas p-kumarynowy rozpuszczony w DMSO,
– 30% nadtlenek wodoru (perhydrol),
– 100% tlenek diwodoru.
Przygotowanie membran do transferu
W technice western-blot wykorzystuje się różne membrany. W trakcie tych ćwiczeń wykorzystujemy membranę Westran, która jest membraną hydrofobową PVDF.
Wykonanie:
1. Wyciąć membrany nieco większe (ok. 2 – 5 mm) od wielkości żelu (uwaga: nie dotykać membrany palcami, używać rękawiczek i pęset).
2. Umieścić na 15 sekund w metanolu, przepłukać dobrze wodą destylowaną i umieścić w buforze do transferu TGM na kołysce na ok. 10 – 15 minut. Przygotować 8 kawałków (wielkości membrany) bibuły Whatman.
Układanie transferu
3. Ułożyć na blacie aparatu do transferu:
4 kawałki bibuły Whatman nasączonej buforem TGM, następnie membranę, żel i kolejne 4 bibuły przygotowane jak powyżej. Przy układaniu transferu należy uważać, aby nie tworzyły się pęcherze powietrza pomiędzy kolejnymi warstwami. Na koniec całość można „przerolować” (np. falkonem) i delikatnie wycisnąć spomiędzy warstw ewentualne pęcherze.
4. Nałożyć pokrywy i przeprowadzić transfer przez około 2 godziny przy stałym napięciu 25V i natężeniu 1,5 – 2 mA na cm2 żelu – im krótszy transfer tym wyższe natężenie.
5. Po zakończeniu transferu żel wybarwić a membranę przenieść do roztworu blokującego (TBST + 5% mleko odtłuszczone) i zostawić na kołysce laboratoryjnej w temperaturze pokojowej na co najmniej 30 min. Na tym etapie, membranę można przechowywać w 4ºC przez kilka dni.
6. Dodać przeciwciała pierwszorzędowe rozcieńczone 1:2500 w 10 ml TBST z 5% mlekiem i pozostawić przez noc na kołysce w 4ºC.
7. Odpłukać przeciwciała roztworem TBST: 2 razy 5 min., 2 razy 15 min.
8. Dodać przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczyć 1:5000 w TBST z mlekiem) i pozostawić na kołysce w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
9. Odpłukać jak wyżej.
UWAGA: Nie wolno dopuścić do wyschnięcia membrany. Obchodzić się z nią delikatnie, używać pęsety. W celu zmniejszenia zużycia przeciwciał należy używać jak najmniejszej objętości buforów, pamiętając jednak, że konieczne jest całkowite zanurzenie membrany.
Dzień 5.
Detekcja metodą ECL
Wykonanie:
Uwaga: W czasie wykonywania eksperymentu, nie należy dotykać powierzchni membrany, pozwoli to uniknąć tła. Nie należy dopuścić do wyschnięcia membrany!
1. Rozmrozić luminol i kwas kumarynowy, zostawić oba odczynniki przez około 5 – 10 minut w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować 10 ml roztworu (10 ml roztworu to ilość potrzebna do wywołania jednej membrany): dodać 50 μl luminolu, 22 μl kwasu kumarynowego, 3 μl nadtlenku wodoru, 1 ml Tris, pH 8,0; dopełnić wodą do 10 ml. Uwaga: Nadtlenek wodoru należy dodać tuż przed użyciem.
3. Przelać przygotowany odczynnik do czystej szalki i zanurzyć w nim membranę na 5 minut; w tym czasie wyciąć z przezroczystej folii (najlepiej „koszulki” na dokumenty, niektóre rodzaje folii, np. saran, mogą powodować powstawanie tła) dwa kawałki o powierzchni nieco większej niż powierzchnia membrany (należy zwrócić uwagę na to, by fragmenty te nie były zabrudzone, matowe bądź ze śladami zagnieceń – pozwoli to uniknąć nadmiernego tła).
4. Membranę delikatnie osuszyć, najlepiej przytrzymując ją przez chwilę pęsetą i delikatnie strzepując nadmiar odczynnika (należy trzymać za róg membrany; ślad po pęsecie może być widoczny na membranie i dawać niespecyficzny sygnał).
5. Membranę delikatnie położyć na wyciętym fragmencie folii i przykryć od góry drugim kawałkiem folii, w razie potrzeby należy pozbyć się pęcherzyków powietrza, w miarę możliwości nie dotykając przy tym membrany. Kolejne etapy będą się odbywały w ciemni fotograficznej przy czerwonej lampie ciemniowej.
6. Na membranę położyć kliszę fotograficzną i zostawić na 2 minuty.
7. Zdjąć kliszę i zanurzyć ją w roztworze wywoływacza aż do pojawienia się prążków (w tym celu należy co jakiś czas wyjmować kliszę z roztworu i sprawdzać, czy pojawił się sygnał).
Uwaga! Gdyby po upływie kilku minut sygnał nadal się nie pojawiał, należy powtórzyć punkt 6, ale wydłużyć czas ekspozycji do 5-15 minut.
Uwaga! Jeśli mimo wydłużonego czasu ekspozycji nie pojawi się sygnał, należy przyjrzeć się kliszy i sprawdzić, czy widoczny jest zarys membrany. Jeśli tak, znaczy to, że sama detekcja została przeprowadzona prawidłowo, a problem wystąpił we wcześniejszych etapach eksperymentu (transfer, przeciwciała). W przypadku, gdy nie widać zarysu membrany na kliszy, należy przypuszczać, że nie powiódł się etap detekcji.
8. Przepłukać kliszę w wodzie i następnie zanurzyć ją na co najmniej 2 minuty w roztworze Utrwalacza.
9. Przepłukać kliszę w wodzie i zostawić do wyschnięcia.
Uwaga! Po wywołaniu, membranę ze związanymi białkami można użyć ponownie (tzn. odpłukać przeciwciała I- i II-rzędowe i powtórzyć inkubację z innymi przeciwciałami). Należy wówczas przechowywać membranę w buforze TBS w chłodni do rozpoczęcia kolejnego eksperymentu.
