biotechnologia


 
 

Gateway cloning

Autor: Karolina Dudziak
Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie

System klonowania Gateway został zaprojektowany tak, aby łączone fragmenty DNA znajdowały się w odpowiedniej kolejności i orientacji. Technologia Gateway uległa komercjalizacji przez firmę Invitrogen i jest szeroko stosowana przez naukowców w pracach z zakresu transformacji genetycznych. Dla systemu tego została opracowana duża ilość kompatybilnych wektorów dla większości aplikacji, które wymagają molekuł o zrekombinowanym DNA.


Mechanizm techniki Gateway opiera się na reakcjach BP i LR. Reakcja BP jest katalizowana przez mieszaninę enzymów BP Clonase II, która zawiera integrazę bakteryjną i czynnik integracji gospodarza. Klonaza powoduje transfer docelowego DNA, którym może być na przykład produkt reakcji PCR oflankowany z obu stron przez miejsca attB, do wektora donorowego (pDONOR), który niesie dwa miejsca attP. Po rekombinacji pasujących attB i attP, fragment DNA jest wstawiany do donoru dając w efekcie tzw. entry clone (pENTR), który jest oflankowany z obu stron miejscami attL. Takie klony mogą również być składane z fragmentów DNA znajdujących się w wektorach, oflankowanych miejscami attL. Proces ten zachodzi przy udziale enzymów restrykcyjnych i ligaz. Miejsca attB zawierają około 21-25 par zasad i są projektowane bez inicjacji translacji czy stop kodonu.


Tak powstały klon (pENTR) jest substratem dla reakcji LR katalizowanej przez mieszaninę enzymów LR Clonase II. Fragment DNA z miejscami attL przenoszony jest do wektora docelowego (pDEST - ang. destination vector), który posiada dwa miejsca attR. Po rekombinacji pasujących miejsc attL i attR fragment DNA jest wstawiany do klonu ekspresyjnego (pEXPR – ang. expression clone) i ponownie zostaje oflankowany przez attB. Wektor donoru (pDONOR), entry clone (pENTR), wektor docelowy (pDEST) i klon ekspresyjny (pEXPR) zostały nazwane tak w celu odróżnienia dodawanych plazmidów. Wektor docelowy przeznaczony jest do szczegółowej analizy funkcjonalnej. Może on ulegać rekombinacji z jakąkolwiek sekwencją uchwyconą w kompatybilnym klonie pENTR i odwrotnie, ten sam klon pENTR może ulegać rekombinacji z wieloma wektorami docelowymi. W wyniku ekspresji klonu powstaje konstrukt używany do testów funkcji genu, na przykład po transformacji roślin.





Rys. Schemat reakcji rekombinacji typu Gateway [Karimi i in. 2007]

Zazwyczaj pożądany plazmid jest tworzony na drodze rekombinacji in vitro i wprowadzany do Escherichia coli, a następnie ulega selekcji, dzięki użyciu odpowiednich antybiotyków. Ważne bowiem jest aby w wektorze docelowy znajdowały się geny oporności na antybiotyki. Powinny być one inne niż w donorze czy klonie pENTR. Większość donorów używanych w reakcji BP zawiera geny oporności na kanamycynę. Klon ekspresyjny powinien zatem zawierać geny oporności na inny antybiotyk.


Kolejnym ważnym czynnikiem przy wyborze i konstrukcji wektora w systemie Gateway, są geny reporterowe, np. GFP (ang. green fluorescence protein) lub RFP (ang. red fluorescence protein), które stały się podstawowym narzędziem w monitorowaniu procesów zachodzących w komórce takich jak transdukcja sygnałów komórkowych czy ekspresja określonych genów. GFP stanowi również podstawowy gen reporterowy wykorzystywany do określenia lokalizacji i funkcji białek komórkowych.


Literatura:
1. Hartley J.L., Temple G.E., Brasch M.A. [2000] DNA cloning using in vitro site specific recombination. Genome Research, 10, 1788-1795.
2. Hellens R.P, Edwards E.A., Layland N.R. I in. [2000] pGreen a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium- mediated plant transformation. Plant Mol Biol, 42, 819-832.
3. Karimi M., Depicker A., Hilson P [2007] Recombinational Clonning with Gateway Vectors. Plant Physiology, 145, 1144-1154.
4. Rosochacki S.J., Matejczyk M. [2007] Gen gfp jako fluorescencyjne narzędzie w analizie ekspresji genów i konstrukcji biosensorów. Biotechnologia, 1(76) 53-62.


Menu główne

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

228 anonymous users oraz 0 registered users online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u