biotechnologia


 
 

Inżynieria genetyczna w zwiększaniu odporności drożdży na stres etanolowy

Autor: Monika Wójcik
Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie

Opracowano wiele metod indukowanej mutagenezy, należą do nich np. transformacja komórki przez DNA badanego genu niosącego fragment obcej sekwencji, w wyniku której gen dziki zostaje zastąpiony genem zmodyfikowanym. Sposób ten zwany jest „rozbiciem genu”. Inną metodą jest sterowana mutageneza punktowa. Służy ona do syntezy oligonukleotydu, który różni się od sekwencji typu dzikiego jednym nukleotydem. Po zmutowaniu oligonukleotyd poddawany jest hybrydyzacji ze sklonowanym na jednoniciowym wektorze M13 dzikiem genem. Następnie do pojedynczej nici in vitro enzymatycznie dosyntetyzowana jest druga nić. Otrzymana cząsteczka po replikacji in vivo daje dwuniciowe cząsteczki potomne typu dzikiego i mutanta w stosunku 1:1. Metoda ta umożliwia usuwanie, dodawanie lub wymianę pojedynczych nukleotydów w dowolnej cząsteczce DNA o znanej sekwencji [2].

Ponadto poprzez manipulację genetyczną można uzyskać szczepy o zwiększonej tolerancji na wysokie stężenia etanolu. Nadekspresja pojedynczych genów odpowiedzialnych m.in. za syntezę nienasyconych kwasów tłuszczowych, trehalozy, białek szoku cieplnego czy L-proliny umożliwia uzyskanie zmodyfikowanych szczepów drożdży o zwiększonej odporności na stres etanolowy.

Jednoczesne operowanie wieloma genami może również być wykorzystywane do sterowania skomplikowaną cechą fenotypową jaką jest tolerancja na etanol. Globalna inżynieria transkrypcyjna gTME opierająca się na zmianach w więcej niż jednym genie została z powodzeniem wykorzystana do zwiększenia odporności na wysokie stężenia alkoholu etylowego [7].



Rys.1. Etapy ulepszania szczepu S. cerevisiae ukierunkowane na poprawę wydajności procesu fermentacji i zwiększenie tolerancji na toksyczny etanol [7].


Dzięki zastosowaniu techniki gTME otrzymano mutanty szczepu Saccharomyces cerevisiae BY4741 posiadające potrójną mutację w genie SPT15, który koduje białko wiążące sekwencję TATA (TBP), wchodzące w skład czynnika transkrypcyjnego TFIID kompleksu preinicjacyjnego wiążącego polimerazę RNA II. Mutanty oznaczone spt 15-300 dzięki zmianom w transkrypcji produkowały o 69% więcej etanolu w porównaniu do szczepu kontrolnego i gromadziły znacznie więcej biomasy komórkowej [1].

Najnowszą metodą umożliwiającą konstruowanie szczepów o ulepszonych właściwościach jest tasowanie genomu (ang. genome shuffling). Technika ta składa się z dwóch etapów:
1) wygenerowania dużej liczby szczepów o różnorodnych genotypach poddawanych następnie fuzji protoplastów,
2) wyboru pożądanego fenotypu z puli uzyskanych hybryd za pomocą klasycznych technik selekcyjnych.

Aby uzyskać dużą liczbę odmiennych genotypów szczepu wyjściowego poddaje się go procesowi mutagenizacji. Czynnikami mutagennymi są najczęściej promieniowanie UV, N-metylo-N’’-nitro-N-nitrozoguanidyna oraz metanosulfonian etylu [3]. Zmutowane szczepy poddaje się następnie procesowi fuzji protoplastów. W celu otrzymania protoplastów komórki inkubuje się w buforze zawierającym enzymy lityczne rozkładające ścianę komórkową oraz glikol polietylenowy (PEG) przyśpieszający zarówno powstawanie protoplastów jak i sam proces fuzji. Hybrydy powstające w wyniku łączenia się protoplastów są następnie poddawane procesowi regeneracji w celu odtworzenia wcześniej zdegradowanej ściany komórkowej. Końcowym etapem tasowania genomu, którego uproszczony schemat został przedstawiony na rysunku nr 12, jest wybór szczepów z pożądanym fenotypem, dzięki przeprowadzeniu testów selekcyjnych lub fermentacyjnych. Aby uzyskać jak najlepsze wyniki proces tasowania genomu można przeprowadzać wielokrotnie [4].



Rys. 2. Schemat procesu tasowania genomu [5].


W badaniach przeprowadzonych przez Shi i wsp. [6] dzięki zastosowaniu trzech rund tasowania genomu uzyskano szczepy Saccharomyces cerevisiae tolerujące stężenie etanolu sięgające 25% (v/v) i zdolne do wzrostu w temperaturze 55oC.


Literatura:
1. Alper H., Moxley J., Nevoigt E., Fink G.R., Stephanopoulos G.: Engineering yeast transcription machinery for improved ethanol tolerance and production., Science, (2006), 314: 1565-1568.
2. Bednarski W., Reps A.: Biotechnologia Żywności., Wydawnictwo Naukowo – Techniczne, Warszawa 2003.
3. Gong J., Zheng H., Wu Z., Chen T., Zhao X.: Genome shuffling: progress and applications for phenotype improvement. Biotechnol. Advan., (2009), 27: 996-1005.
4. Hou L.: Improved production of ethanol by novel genome shuffling in Saccharomyces cerevisiae. Appl Biochem Biotechnol. (2010), 160(4):1084-1093.
5. Leja K., Myszka K., Czaczyk K.: Genome shuffling: a method to improve biotechnological processes., J. Biotechnol., Comp. Biol. and Bionanotechnol., (2011), 92(4): 345-351.
6. Shi D.J., Wang C.L., Wang K.M.: Genome shuffling improve thermotolerance, ethanol tolerance and ethanol productivity of Saccharomyces cerevisiae., J. Ind. Microbiol. Biotechnol., (2009), 36: 139-147.
7. Zhao X. Q., Bai F.W.: Mechanisms of yeast stress tolerance and its manipulation for efficient fuel ethanol production., J. Biotechnol., (2009), 144: 23-30.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

202 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u