biotechnologia


 
 

Izolacja RNA

Izolacja RNA IBB PAN PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Fragment skryptu: Biologia molekularna roślin

Uniwersytet Warszawski (www)
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN (www)
Zakład Biologii Molekularnej Roślin (www)
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

Adres:
ul. Pawińskiego 5a,
02-106 Warszawa

Kontakt: tel. (+48 22) 592 5704,
E-mail: andyj@ibb.waw.pl


Zakład Biologii Molekularnej Roślin

Problematyka badawcza: Rola struktury chromatyny w regulacji rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na czynniki stresowe i hormonalne. Prowadzone aktualnie badania mają na celu poznanie funkcji roślinnych kompleksów remodelujących chromatynę, histonu H1 i modyfikacji potranslacyjnych histonów rdzeniowych, a także opisanie proteomu jądrowego rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.
Stosowane techniki: Większość metod biologii molekularnej, metody biochemii białek, analiza proteomiczna (mass-spec) i transkryptomiczna (mikromacierze), genetyka Arabidopsis thaliana (konstrukcja i analiza mutantów), metody bioinformatyczne.
_______________________________________________________________________________


RNA jest znacznie bardziej narażony na degradację niż DNA. W materiale biologicznym oraz w środowisku zewnętrznym obecna jest duża ilość bardzo aktywnych i stabilnych rybonukleaz. Nawet po zastosowaniu wysokiej temperatury, np. 100°C, a także w obecności detergentów, np. SDS, enzymy te zachowują aktywność. Ponadto, wiele rybonukleaz nie wymaga dla swej aktywności kofaktorów, np. jonów dwuwartościowych, w związku z czym enzymu nie możemy zablokować stosując EDTA. Dlatego podczas izolacji RNA do inaktywacji RNaz należy stosować bardzo silne związki denaturujące białka, takie jak chlorowodorek guanidyny lub izotiocjanian guanidyny. Związki te, oprócz denaturacji rybonukleaz, umożliwiają również zniszczenie struktur komórkowych. RNazy powinny zostać również usunięte ze sprzętu używanego do izolacji. Do tego celu stosuje się inhibitory RNaz, tj. DEPC (dietylopirowęglan). W postaci 0,1% roztworu wykorzystujemy go do płukania sprzętu mającego kontakt z RNA oraz do przygotowywania niektórych buforów. Należy pamiętać aby roztwór ten poddać autoklawowaniu inaktywującemu DEPC, który jest silnie toksyczny. DEPC nie poddany inaktywacji blokuje aktywność enzymów wykorzystywanych na kolejnych etapach prac z RNA, np. odwrotnej transkryptazy.

elektroforeza RNA Kolejnym, często stosowanym inhibitorem RNaz, jest tzw. RNazin - białko które inaktywuje RNazy wiążąc się z nimi. Inhibitor ten może towarzyszyć RNA podczas przechowywania oraz podczas reakcji enzymatycznych, gdyż nie powoduje inhibicji innych enzymów. Podczas izolacji RNA należy usunąć towarzyszący mu DNA. W tym celu stosuje się ekstrakcję fenolem o niskim pH. Kwaśny fenol powoduje usunięcie nadmiaru DNA z roztworu. DNA pozbywamy się również wytrącając RNA chlorkiem litu (LiCl). Dokładne usunięcie resztek DNA z preparatu można uzyskać wykonując trawienie DNazą wolną od RNaz.

W komórkach eukariotycznych cząsteczki rRNA, tRNA oraz RNA niskocząsteczkowy stanowią łącznie ok. 80-98% RNA komórkowego. Dlatego, jeżeli interesuje nas tylko pula mRNA, należy zastosować dodatkowy etap izolacji, podczas którego usuwamy z preparatu pozostałe kwasy rybonukleinowe. Stosowane w tym celu techniki wykorzystują fakt, że cząsteczki mRNA na 3’ końcach zawierają sekwencje poli(A). Sekwencje te mogą zostać związane z cząsteczkami poli(T) przyłączonymi do stałego podłoża np. w kolumnach chromatograficznych lub na kuleczkach magnetycznych.

Cząsteczki RNA nie związane z podłożem są następnie odmywane a oczyszczone cząsteczki mRNA poddawane są elucji. Po rozdziale elektroforetycznym całkowitego RNA w żelu agarozowym najlepiej widoczne są frakcje rRNA (Rys. 1). Ich obraz może być wykorzystany jako orientacyjny marker mas cząsteczkowych, gdyż znane są wielkości podstawowych frakcji rRNA występujących u poszczególnych organizmów. Intensywność prążków rRNA informuje nas o jakości preparatu, ich zanikanie świadczy o postępującej degradacji RNA. Frakcje mRNA, ze względu na ichniewielką ilość w preparacie oraz zróżnicowaną wielkość, charakterystyczną dla poszczególnych genów, nie są widoczne na żelach po rozdziale RNA całkowitego (Rys. 1. Żel agarozowy całkowitego RNA).

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

81 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u