Wniknięcie patogena, jak również symbionta do organizmu roślinnego, wyzwala w roślinie mechanizmy obronne, które można podzielić na dwie grupy:
Reakcje lokalne:
* reakcje nadwrażliwości (ang. hypersensitive response; HR)
Reakcje HR wywoływane są kontaktem patogena z komórkami roślinnymi. Następuje wzrost ilości aktywnych form tlenu (ang. Active Oxygen Species, AOS) np. O2-, H2O2 i w konsekwencji wybuch tlenowy (ang. oxydative burst). ASO wraz z NO działają cytotoksycznie na zakażone komórki. Reakcje HR pojawiają się najszybciej. Prowadzą do przeorganizowania cytoszkieletu, zwiększenia grubości ścian komórkowych, fragmentacji roślinnego DNA i ostatecznie do apoptozy komórek gospodarza, co uniemożliwia dalsze rozprzestrzenianie się patogena ponieważ pozbawia go źródła substancji pokarmowych pochodzących z żywych komórek. Wyjątkiem są nekrotroficzne grzyby, których rozwój uzależniony jest od występowania martwych tkanek gospodarza. Toksycznie wobec patogena działa też szereg metabolitów wtórnych – fitoaleksyn. W reakcjach nadwrażliwości biorą też udział tzw. białka obronne tj. bogate w glicynę i serynę kwaśne białka strukturalne ścian komórek roślinnych (ang. glycine and serine rich proteins, GSRP). Przy podwyższonym stężeniu AOS ulegają one usieciowaniu co zmniejsza przepuszczalność ścian komórkowych ograniczając tym samym zasięg infekcji.
Reakcje systemiczne:
* systemiczna odporność nabyta (ang. systemic acquired resistance; SAR)
Ten rodzaj odporności jest następstwem reakcji HR. Polega na aktywacji systemu obronnego w niezainfekowanych częściach rośliny. Wyzwalana jest dzięki produkcji białek związanych z patogenezą (ang. pathogenesis-related proteins, PR). Sygnałem do tej odpowiedzi jest kwas salicylowy. Wyróżnia się obecnie czternaście klas roślinnych białek PR. Są to m.in. glukanazy, chitynazy, osmotyny, inhibitory proteaz, proteinazy, lizozymy, peroksydazy, białka działające bakteriobójczo, uczestniczące w apoptozie. Ekspresja kodujących je genów zależy od obecności pochodzącego od patogena bodźca – elicytora, odbieranego przez specyficzne receptory, które za pośrednictwem kinaz należących do rodziny MAPK (ang. mitogen-activated protein kinases) przekazują sygnał do ich indukcji. W regulacji ekspresji tych genów uczestniczą m.in. cytokininy.
* systemiczna odporność indukowana (ang. induced systemic resistance; ISR)
Rolę cząstki sygnalnej spełnia tu kwas jasmonowy i etylen. ISR aktywowana jest elicytorami podobnymi jak w przypadku SAR i prowadzi do:
– akumulacji fenoli w pobliżu miejsca wniknięcia patogena;
– wzrostu ilości flawonoidów w tkankach sąsiadujących z miejscem inwazji;
– syntezy licznych białek PR transportowanych przez plasmodesmy do wszystkich organów rośliny lub wydzielanych do ryzosfery.
Jeśli infekujący roślinę mikroorganizm zostanie rozpoznany jako zgodny mikrosymbiont, roślina kontroluje intensywność mechanizmów obronnych. Jest to tzw. pasywne ominięcie (ang. passive evasion) – charakterystyczne dla rizobiów. Aby uniknąć skutków mechanizmów obronnych, rizobia muszą w krótkim czasie kolonizować tkanki gospodarza, co możliwe jest dzięki szybkiemu wytwarzaniu i wzrostowi nici infekcyjnych, które pozwalają na przyspieszenie inwazji na tyle, aby przebiegała ona w tkankach niezmienionych przez mechanizmy obronne i wyprzedziła lokalne nekrozy, które zatrzymałyby jej rozwój. W takiej sytuacji także roślina wspomaga rozwój nici infekcyjnej angażując:
– lektyny (współdziałające z bakteryjnym EPS w budowie matrix nici infekcyjnej);
– białka strukturalne (do budowy nici infekcyjnej);
– enzymy hydrolityczne (wraz z enzymami bakteryjnymi degradują ściany komórek roślinnych stojących na drodze nici infekcyjnej).
Cząstki sygnalne związane z obroną roślin
Wykazano, że namoczenie ziaren fasoli Vigna mungo w kwasie salicylowym przed ich wysianiem, zmniejsza liczbę tworzonych brodawek, zawartość białka i aktywność nitrogenazy w korzeniach. Użycie go przed zakażeniem lucerny (alfalfa) rizobiami lub oczyszczonymi czynnikami Nod, zmniejsza liczbę i suchą masę jej brodawek oraz opóźnia ich powstawanie.
Kwas salicylowy lub indukowana przez niego SAR, mogą być zaangażowane w autoregulację brodawkowania. Kiedy roślina rozpoznaje zgodnego mikrosymbionta, poziom kwasu salicylowego w korzeniach lucerny nie wzrasta, jak ma to miejsce w przypadku rozpoznania patogena. Rośnie natomiast w roślinach zakażonych rizobiami niezgodnymi lub zgodnymi, ale nie tworzącymi czynników Nod, czy też mutantami z zablokowaną ich syntezą. Stąd wniosek, że funkcją czynników Nod jest zahamowanie wywoływanej przez kwas salicylowy obrony rośliny.
Tlenek azotu reguluje ekspresję genów niezbędnych do wiązania azotu w brodawkach. Jest też inhibitorem nitrogenazy. Wiąże się mocno do leghemoglobiny (Lb) soi i wspięgi (cowpea) tworząc kompleks nitrozoleghemoglobiny (NO-Lb), co wskazuje, że Lb ma wyższe powinowactwo do NO niż do tlenu. NO-Lb może być mechanizmem ochronnym, który w brodawkach zapobiega hamowaniu aktywności nitrogenazy przez NO. Akumulacja tego kompleksu może doprowadzić do inhibicji nitrogenazy, ponieważ wiązanie NO do Lb konkuruje z wiązaniem tlenu, zmniejszając jego dostawę do bakteroidów, co obniża wiązanie azotu. Rośliny mogą indukować syntezę NO w odpowiedzi na nadmiar egzogennego azotanu jako sposób regulacji wiązania azotu. Ilość NO-Lb jest największa w młodych brodawkach, spadając z ich wiekiem, a w starzejących się jest prawie nieobecna.
Reaktywne/aktywne formy tlenu (ang. Reactive/Active Oxygen Species; ROS/AOS) (np. H2O2, O2-, *OH) wyzwalane są zaraz po rozpoznaniu patogena. Umacniają ściany komórkowe, wywołują HR, indukują SAR i apoptozę komórki. Składniki roślinne, jak i bakteryjne biorą udział w ochronie przed szkodliwymi skutkami ich działania. Są to m.in. peroksydazy, katalazy, dysmutaza ponadtlenkowa. Aktywność peroksydazy wzrasta po zakażeniu w miejscu deformacji włośników. Aby infekcja była skuteczna rizobia muszą najpierw zahamować jej aktywność. Spadek aktywności peroksydazy może być wywołany przez bakteryjny EPS. Jednakże wysoka aktywność peroksydazy jest potrzebna do naprawy ścian komórek włośników, uszkodzonych podczas wtargnięcia rizobiów i tworzenia nici infekcyjnej. Glikoproteiny matriks na szczycie nici infekcyjnej są za sprawą peroksydazy nierozpuszczalne, co stanowi barierę hamującą postęp inwazji bakteryjnej. Pozwala to bakteriom posuwać się naprzód dopóki jej aktywność w tym rejonie utrzymuje się na wystarczająco niskim poziomie by uniknąć utwardzenia szczytu nici infekcyjnej.
Szkodliwe dla nodulacji działanie ROS, polega na uszkadzaniu i degenerowaniu białek, DNA, lipidów obu symbiontów. Poziomy reaktywnych form tlenu są często podwyższone w starzejących się tkankach brodawki. ROS takie jak O2- i rodniki hydroksylowe hamują wiązanie azotu.
Stres oksydacyjny wpływa na różne etapy symbiozy. Zakażenie M. truncatula przez Sinorhizobium meliloti pozbawionych detoksyfikacyjnej dysmutazy ponadtlenkowej osłabia nodulację, wywołuje nieprawidłową infekcję, nieprzekształcanie się rizobiów w bakteroidy oraz szybkie ich starzenie. Zależnie od ilości, ROS spełniają dwie funkcje: wiele z nich jest toksynami indukującymi stres oksydacyjny, a w mniejszych stężeniach wyzwalają „up-regulację” enzymów antyoksydacyjnych.
Reakcja ROS z NO prowadzi do powstania cytotoksycznych jonów peroksynitrylowych ONOO– , które podobnie jak same ROS bezpośrednio zabijają mikroorganizmy patogenne. NO przyczynia się do wzrostu syntezy związków bakteriostatycznych i grzybobójczych m.in. kwasu salicylowego (SA) aktywującego syntezę białek PR. Może też wpływać na podwyższenie poziomu Fe2+, które reagując z H2O2 tworzą cytotoksyczne rodniki hydroksylowe. Procesy te doprowadzają do powstania lokalnych nekroz ograniczających rozprzestrzenianie się patogena. Są to mechanizmy reakcji nadwrażliwości HR. NO w postaci nitrozoglutationu (GSNO) transportowany jest poprzez floem do niezainfekowanych jeszcze części rośliny uruchamiając nabytą odporność systemową (SAR).
Kwas jasmonowy (JA) wywołuje akumulację mRNA lipooksygenazy (LOX), jak również jest produkowany w wyniku jej działania na wielonienasycone kwasy tłuszczowe. Ester metylowy kwasu jasmonowego (MeJA) sprzyja biosyntezie kwasu salicylowego (SA), a jego aplikacja do korzeni L. luteus promuje syntezę i sekrecję izoflawonoidu – genisteiny. Prawdopodobnie pozytywnie wpływa na etap infekcji.
Brasinosteroidy wpływają na tworzenie brodawek, ponieważ pozbawione ich mutanty grochu tworzą znacznie mniej brodawek niż typ dziki. Ich dolistna aplikacja w przypadku orzecha ziemnego (Arachis hypogaea) podnosi znacznie liczbę i masę brodawek oraz aktywuje nitrogenazę. Przeciwnie oddziałują na korzenie soi – zmniejszają liczbę noduli i efektywność wiązania azotu. Różnice te mogą wynikać z użycia odmiennych metod badawczych i gatunków roślin.
Flawonoidy to roślinne metabolity wtórne wydzielane przez korzenie roślin motylkowatych, gł. w strefie występowania młodych, ale w pełni rozwiniętych włośników. Zależnie od gatunku rośliny specyficznie indukują bakteryjne geny nod. Wywołują dodatnią chemotaksję rizobiów do korzeni, a ich produkcja w korzeniach i brodawkach jest przez te bakterie indukowana. Flawonoidy lokalizują się szczególnie w dzielących się tkankach merystematycznych, w tym w komórkach kory korzenia w obrębie powstającej brodawki. Prawdopodobnie ze względu swoja aktywność antyoksydacyjną chronią dzielące się komórki przed tego typu zniszczeniem. Mogą też wpływać na podziały komórkowe regulując transport lub obrót auksyn, kontrolując ich akumulację, albo bezpośrednio oddziałując na regulatory cyklu komórkowego.
Urydyna zidentyfikowana została jako tzw. „stele factor”, czyli sygnał dyfundujący z ksylemu, który wspólnie z auksynami i cytokininami uczestniczy w indukcji podziałów komórkowych, m.in. podczas powstawania brodawek. Różnice w stężeniu urydyny pomiędzy przodem ksylemu a biegunami floemu mogą wyjaśniać preferencje brodawek do zapoczątkowywania podziałów komórek na przeciwległych biegunach ksylemu. Inicjacja powstawania brodawek typu zdeterminowanego ma miejsce w zewnętrznych komórkach kory, zaś podziały komórek wewnętrznych prowadzą do rozwoju brodawek niezdeterminowanych. Może to wynikać z różnic we wrażliwości poszczególnych gatunków roślin na urydynę.
Azotan w stężeniu powyżej 1-5 mM hamuje lokalnie nodulację na poziomie infekcji, inicjacji tworzenia zawiązków brodawek, jak i wiązania azotu. Sam z siebie nie jest inhibitorem tego procesu, ponieważ istnieją mutanty, które w jego obecności wykazują hypernodulację. Zakłada się, że azotan podnosi wrażliwość korzenia na auksyny, co negatywnie reguluje brodawkowanie. Regulacyjny wpływ azotanu może też przebiegać poprzez oddziaływanie na akumulację flawonoidów w korzeniach, co zmienia transport auksyn, czy też aktywność genów nod. Azotan indukuje produkcję hamującego nodulację etylenu, powoduje obniżenie indukcji ENOD40 przez rizobia, ale nie przez cytokininy.
Spekuluje się, czy czynniki Nod są sygnałami działającymi jak hormony (ang. „hormone-like signals”/”hormone-like molecules”) czy też działają pośrednio np. zmieniając równowagę hormonalną rośliny. Rolę podobną do hormonów przypisuje się natomiast oligosacharydom chityny, mającym bardziej ogólną rolę w rozwoju rośliny. Stwierdzono, że czynniki Nod stymulują embriogenezę nienodulującego świerku norweskiego (ang. Norway spruce), a udział tego typu związków wykryto też w rozwoju zwierząt.
Marta Muszyńska
Literatura:
1. Carroll B.J., McNeil D.L., Gresshoff P.M. (1985) „Isolation and properties of soybean (Glycine max) mutants that nodulate in the presence of high nitrate concentrations.” Proc Natl Acad Sci USA 82:4164-4166
2. Catford J-G., Staehelin C., Lerat S., Piché Y., Vierheilig H. (2003) „Suppression of arbuscular mycorrhizal colonization and nodulation in split – root system of alfalfa after pre – inoculation and treatment with Nod factors” Journal of Experimental Botany 54/386:1481-1487
3. Crespi M., Gálvez S. (2000) „Molecular Mechanisms in Root Nodule Development” J Plant Growth Regul 19:155-166
4. Coronado C., Zuanazzi J.A.S., Sallaud C., Quirion J.C., Esnault R., Husson H.P., Kondorosi A., Ratet P. (1995) „Alfalfa root flavonoid production is nitrogen regulated” Plant Physiol 108:533-542
5. Dyachok J.V., Wiweger M., Kenne L., von Arnold S. (2002) „Endogenous nod-factor-like signal molecules promote early somatic embryo development in Norway spruce.” Plant Physiol 128:523-533
6. Ferguson B.J., Mathesius U. (2003) „Signaling Interactions During Nodule Development” J Plant Growth Regul 22:47-72
7. Gundlach H., Müller M.J., Kutchan T.M., Zenk M.H. (1992) „Jasmonic acid is a signal transducer in elicitor-induced plant cell cultures.” Proc Natl Acad Sci 89:2389-2393
8. Kanayama Y., Yamamoto Y. (1990) „Inhibition of nitrogen fixation in soybean plants supplied with nitrate II. Accumulation and properties of nitrosylleghemoglobin in nodules.” Plant cell Physiol 31:207-214
9. Kopcewicz J., Lewak S. (2002) „Fizjologia roślin” PWN Warszawa
10. Martinez-Abarca F., Herrera-Cervara J.A., Bueno P., Sanjuan J., Bisseling T., Olivares J. (1998) „Involvement of salicylic acid in the establishment of the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiosis.” Mol Plant-Microbe Interact 11:153-155
11. Maassen A., Hennig J. (2001) „Udział tlenku azotu w odpowiedzi roślin na infekcje” Postępy biochemii 47(2):192-199
12. Jakubowska A., Kowalczyk K. (1998) „Biochemiczne i molekularne podstawy symbiotycznych oddziaływań bakterii i roślin” Postępy biochemii 44(1):73-82
13. Maskell C.S., Gibson J.F., Dart P.J. (1977) „Electron-paramagneticresonance studies of leghaemoglobins from soya-beans and cowpea root nodules.” Biochem J 167:435-445
14. Mathesius U., Charon C., Rolfe B.G., Kondorosi A., Crespi M. (2000) „Temporal and spatial order of events during yhe induction of cortical cell divisions in white clover by Rhizobium leguminosarum bv. trifolii inoculation or localized cytokinin addition.” Mol Plant-Microbe Interact 13:617-628
15. Mathieu C., Moreau S., Frendo P., Puppo A., Davies M.J. (1998) „Direct detection of radicals in intact soybean nodules: presence of nitric oxide-leghemoglobin complexes.” Free Radic Biol Med 24:1242-1249
16. Porta H., Rueda-Benitez P., Campos F., Colmenaro-Flores J.M., Colorado J.M., Carmona M.J., Covarrubias A.A., Rocha-Sosa M. (1999) „Analysis of lipoxygenase mRNA accumulation in the common bean (Phaseolus vulgaris L.) during development and under srtess conditions.” Plant Cell Physiol 40:850-858
17. Pasternak O., Sikorski M.M. (2002) „Cytokininy w mechanizmach obronnych roślin” Biotechnologia 3(58):153-164
18. Salzwedel J.L., Dazzo F.B. (1993) „pSym nod gene influence on elicitation of peroxidase activity from white clover and pea roots by rhizobia and their cell-free supernatants.” Mol Plant-Microbe Interect 6:127-134
19. Santos R., Hérouart D., Puppo A., Touati D. (2000) „Critical protective role of bacterial superoxide dismutase in Rhizobium-legume symbiosis.” Mol Microbiol 38:750-759
20. Schultze M., Kondorosi A. (1998) „Regulation of symbiotic root nodule development” Annu. Rev. Genet. 32:33-57
21. Ruiz-Lozano J.M., Roussel H., Gianinazzi S., Gianinazzi-Pearson V. (1999) „Defense gene are differentially induced by a mycorrhizal fungus and Rhizobium sp. In wild-type and symbiosis-defective pea genotypes” Mol Plant-Microbe Interact 12:976-984
22. Rice-Evans C. (2001) „Flavonoid antioxidants” Curr Med Chem 8:797-807
23. Streeter J.G. (1988) „Inhibition of legume nodule formation and N2 fixation by nitrate.” Crit Rev Plant Sci 7:1-23
24. Trinchant J.C., Rigaud J. (1982) „ Nitrite and nitric oxide as inhibitors of nitrogenase from soybean bacteroids.” Appl Environ Microbiol 44:1385-1388
25. Van Loon L.C., Van Strien E.A. (1999) „The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins” Physiol Mol Plant Pathol 55:85-97
26. Van Rhijn P., Vanderleyden J. (1995) „The Rhizobium – Plant Symbiosis” Microbiol. Reviews 59/1:124-142
27. Vardhini B.V., Rao S.S.R. (1999) „Effect of brassinosteroids on nodulation and nitrogenase activity in groundnut (Arachis hypogaea L.).” Plant Growth Regul 128:165-167
28. Wielbo J., Skorupska A. (2003) „Strategie symbiotycznych Rizobiów w pokonywaniu reakcji obronnych roślin motylkowatych” Postępy Biologii Komórki 30 /3:433-446
29. Wisniewski J.P., Rathbun E.A., Knox J.P., Brewin N.J. (2000) „Involvement of diamine oxidase and peroxidase in insolubilization of the extracellular matrix: implications for pea nodule initiation by Rhizobium leguminosarum.” Mol Plant Microbe Interact 13:413-420
