biotechnologia


 
 

Metody analizy molekularnej genów kodujących rybosomalne RNA – metody rybotypowania

Autor: Elwira Komoń-Janczara

Ustalenie prawdziwych, ewolucyjnych zależności pomiędzy gatunkami i taksonami wyższej rangi musi opierać się na cząsteczkach, które spełniają ważne kryteria. Najważniejszym wymogiem jest ich obecność we wszystkich badanych bakteriach. Muszą one również pełnić równoważne funkcje w komórce a także posiadać w swojej budowie zarówno sekwencje konserwatywne, jak i zmienne. Analizując te fragmenty możliwe jest uzyskanie informacji o odległościach ewolucyjnych pomiędzy badanymi organizmami. Ponieważ DNA cechuje duża podatność na różnego rodzaju mutacje, nie może ono dokładnie odzwierciedlać zależności pomiędzy grupami taksonomicznymi.

Wykazano, że niezbędne wymagania spełnia rybosomalne RNA. Z trzech jego rodzajów najbardziej przydatne do analiz okazało się 16S rRNA u prokariotów (w artykule większą uwagę poświecono różnicowaniu mikroorganizmów prokariotycznych) i 28S rRNA u eukariontów. W odniesieniu do prokariotów, 5S rRNA ma zbyt krótką sekwencję, by mogło być stosowane do analizy porównawczej. Przyjmuje się, że mikroorganizmy należące do tego samego rodzaju muszą posiadać 111-116 wspólnych nukleotydów. Cała cząsteczka 5S rRNA ma długość jedynie 118-120 nukleotydów, podczas gdy 16S rRNA składa się z ok. 1500 nukleotydów. Analizie poddaje się również cząsteczkę 23S rRNA, lecz jest ona znacznie rzadziej stosowana w badaniach nad ustalaniem filogenetycznego pochodzenia mikroorganizmów.

Obecnie jednak, zamiast badać bezpośrednio cząsteczki RNA, które cechują się dosyć małą stabilnością, analizie poddaje się sekwencje kodującego je DNA. Daje to możliwość badania rejonów zmiennych 16S rRNA organizmów o nieznanej sekwencji genomu. Wystarczy użyć primerów komplementarnych do wysoce konserwatywnych fragmentów flankujących gen 16S rRNA.



Podział metod rybotypowania

Rybotypowanie obejmuje ogół metod zajmujących się analizą molekularną genów kodujących rybosomalne RNA. Analizy te opierają się na różnego typu metodach biologii molekularnej. Podział metod sugeruje technikę, którą wykorzystano podczas badania jako podstawową.

Wśród metod rybotypowania wyróżniono:
- metody oparte na reakcji PCR (Polymerase Chain Reaction)
-- ITS – RFLP – polimorfizm długości produktów PCR
-- Analiza restrykcyjna amplifikowanego rDNA (ARDRA)
-- PCR regionu zawierającego gen kodujący 16S rRNA/28S rRNA

- metody oparte na hybrydyzacji
-- rrn RFLP zhybrydyzowanego z sondą rDNA ( rrn locii)


ITS – RFLP – polimorfizm długości produktów PCR

W związku z rosnącą dostępnością i malejącymi kosztami wysokosprawnego sekwencjonowania możliwe stało się wykorzystanie oznaczenia sekwencji genów kodujących regiony zmienne 16S rRNA. Przedmiotem badań są najczęściej regiony V1 – V3, których porównanie jest dobrym narzędziem do identyfikacji gatunków i analizy filogenetycznej. Jednakże, mimo iż metoda ta daje wiarygodne wyniki podczas określania dystansu ewolucyjnego, nie zawsze jest wystarczająca do rozróżnienia blisko spokrewnionych gatunków. Wszystko to ze względu na zbyt powolne zmiany w sekwencjach samego genu 16S rRNA, które nie odzwierciedlają właściwych różnic między poszczególnymi szczepami tego samego gatunku. Dlatego też stosuje się metody oparte na sekwencjonowaniu i analizie porównawczej regionów znajdujących się pomiędzy genami kodującymi 16S i 23S rRNA w operonie rrn. Dodatkowo spacer regions zawierają różną liczbę genów kodujących tRNA, co również może być cenną informacją podczas różnicowania. Ponieważ sekwencje spacer regions są mniejsze niż sekwencje 16S rDNA (mają długość ok. 200 pz) i liczba kopii operonów rrn w genomach bakterii jest różna, występują liczne allele genów 16S rRNA. Dodatkowo w sekwencjach międzygenowych występują różnice pomiędzy gatunkami. To wszystko skutkuje tym, iż otrzymujemy sprawną metodę rozróżniania szczepów. Metoda ta daje większe prawdopodobieństwo wiarygodnych wyników niż analiza genów 16S rRNA. Zautomatyzowanie tej metody (ARISA – Automated Aproach of Ribosomal Intergenic Spacer Analysis) zostało zaprojektowane to szybkiego oznaczania mikrobiologicznej różnorodności gatunków żyjących w czystej wodzie.



Analiza restrykcyjna amplifikowanego rDNA (ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis)

Analiza ta również wykorzystuje reakcję PCR. Docelowe rDNA jest amplifikowane przy użyciu uniwersalnych primerów. Te mogą być dobierane jedynie do sekwencji flankujących geny 16S rRNA lub mogą służyć do amplifikacji całego operonu rrn, który obejmuje geny kodujące 16S rRNA, 23S rRNA oraz sekwencję IGS (intergenic spacer region), która znajduje się pomiędzy tymi genami. Dobór primerów zależy od celu przeprowadzania analizy.

Po amplifikacji odpowiednich fragmentów produkt reakcji PCR poddawany jest trawieniu enzymami restrykcyjnymi. Wybór właściwych enzymów jest oparty na przeszukaniu informacji o sekwencjach genomów badanych szczepów, które dostępne są w bazach danych GeneBanku. Pozwala to na określenie miejsc cięcia enzymów. Po odnalezieniu sekwencji, które zawierają interesujący gen lub fragment niekodujący, enzymy dobierane są tak, aby cięły DNA nie niszcząc odcinka służącego do analizy porównawczej między poszczególnymi szczepami. Po kilku lub kilkunastogodzinnej reakcji trawienia (w zależności od dobranego enzymu), następuje rozdział elektroforetyczny na żelu w celu uzyskania profili prążków charakterystycznych dla badanych mikroorganizmów.



Ogólna analiza sekwencji rDNA

Metoda ta wykorzystuje przede wszystkim amplifikację odpowiednich fragmentów rDNA w reakcji PCR. Kolejne etapy postępowania z produktem amplifikacji zależą od potrzeb badawczych. Primery stosowane w tej metodzie mają za zadanie namnożyć fragment DNA odpowiedzialny za kodowanie podjednostek rybosomów i są one komplementarne do konserwatywnych sekwencji flankujących badany rDNA. Analizy najczęściej przeprowadza się na genach kodujących 16S rRNA. Wykorzystuje się tu uniwersalne primery o sekwencjach przedstawionych w Tab. 1.


Tab. 1. Sekwencje uniwersalnych primerów używanych do amplifikacji genu 16S rRNA.
Primer Sekwencja

16S rRNA Forward

5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’

16S rRNA Reverse

5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’

28S rRNA Forward

5’-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3’

28S rRNA Reverse

5’-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3’


Po amplifikacji otrzymany produkt poddawany jest najczęściej rozdziałowi elektroforetycznemu na żelu o odpowiedniej gęstości. Otrzymane prążki są analizowane pod względem ich mas molekularnych. Prążek odpowiadający oczekiwanej wielkości jest izolowany z żelu a następnie poddawany sekwencjonowaniu. W bazach danych Ribosomal Database Project (RDP) dostępnych jest obecnie 3 019 928 uszeregowanych sekwencji 16S rRNA oraz 102 901 sekwencji 28S rRNA odnoszących się do grzybów strzępkowych (dane z dn. 17.09.2014, http://rdp.cme.msu.edu/), które służą jako wzorce do porównania z fragmentami otrzymanymi po amplifikacji i ich zsekwencjonowaniu. Jest to metoda pozwalająca na klasyfikację mikroorganizmów, nawet jeśli nie mogą być one hodowane na pożywkach. Materiał do badań może pochodzić bezpośrednio z prób pobranych ze środowiska ich życia. Tego typu analizy są często wykorzystywane w diagnostyce medycznej, gdy ważny jest czas wykrycia przyczyny zakażenia.



Analiza restrykcyjna rrn zhybrydyzowanego z sondą rDNA (rrn loci)

Metoda rozpoczyna się od izolacji genomowego DNA. Następnie, odpowiednio dobrane enzymy restrykcyjne tną DNA, dając w efekcie fragmenty o różnych długościach, które poddawane są rozdziałowi w procesie elektroforezy na żelu. Po rozdziale otrzymuje się profil prążków, które z kolei przenoszone są na membranę nylonową lub nitrocelulozową. Ta połączona jest z wyznakowaną sondą oligonukleotydową, zaprojektowaną tak, aby hybrydyzowała z fragmentami kodującymi rRNA. Innym sposobem może być przeniesienie potrawionego DNA z żelu na membranę a następnie dodanie mieszaniny zawierającej wybraną sondę komplementarną do konserwatywnych regionów w genach kodujących rRNA. Rybotypowanie może być wykonywanie ręcznie lub pół – automatycznie (RiboPrint). Zautomatyzowanie części procedury oszczędza czas, lecz jak wynika z badań, daje mniej dokładną analizę.

Do zalet rybotypowania należy możliwość oznaczenia dowolnych szczepów, powtarzalność metody, wysoka zdolność różnicowania, otrzymywanie prostych profili prążkowych. Wadą tej techniki jest jednak czasochłonność.



Literatura:
1. Baj J., Markiewicz Z., Biologia molekularna bakterii, (2006) Wydawnictwo Naukowe PWN.
2. Amann, R. I., Ludwig,W., & Schleifer, K. H. (1995). Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiology Reviews, 59, 143–149.
3. Vandamme, P., Pot, B., Gillis, M., De Vos, P., Kersters, K., & Swings, J. (1996). Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics. Microbiology Reviews, 60, 407–438.
4. Tannock, G. W., Tilsala-Timisjarvi, A., Rodtong, S., Ng, J., Munro, K., & Alatossava, T. (1999). Identification of Lactobacillus isolates from the gastrointestinal tract, silage, and yoghurt by 16S–23S rRNA gene intergenic spacer region sequence comparisons. Applied and Environmental Microbiology, 65, 4264–4267.
5. Gurtler, V., & Stanisich, V. A. (1996). New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S–23S rDNA spacer region. Microbiology Reviews, 142, 3–16.
6. Fisher M. M., Triplett E. W., Automated Approach for Ribosomal Intergenic Spacer Analysis of Microbial Diversity and Its Application to Freshwater Bacterial Communities, Applied end Environmental Microbiology, Oct. 1999, p. 4630–4636.
7. Singh S., Goswami P., Singh R., Heller K. J., (2009), Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: A review, LWT - Food Science and Technology 42 (2009) 448–457.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

138 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u