Spektrometria mas jest techniką analityczną, która w ciągu ostatniego stulecia uległa dynamicznemu rozwojowi. Począwszy od skonstruowania pierwszego spektrometru przez Josepha Johna Thomsona w 1911 roku do czasów współczesnych przeszła długą drogę doskonalenia, dzięki czemu dziś jest cenioną techniką pozwalającą na identyfikację związków chemicznych oraz precyzyjne określenie składu złożonych struktur. Do zasadniczego postępu w tym kierunku przyczyniło się powstanie nowych metod łagodnej jonizacji próbek biologicznych, które znalazły zastosowanie w proteomice, metabolomice oraz chemii materiałów i polimerów. Imponujące osiągnięcia w metodach LDI dostarczyły nowych możliwości w dziedzinie obrazowania tkanek biologicznych, co przyczyniło się do pogłębienia wiedzy na temat ich funkcjonowania, a także pomogło w zrozumieniu procesów patofizjologicznych.
Techniki LDI wykorzystujące proces transferu energii zostały wprowadzone w późnych latach 60 ubiegłego wieku jako obiecująca perspektywa badania biocząsteczek umiejscowionych na powierzchni płytki. Istotą tego mechanizmu jest wprowadzenie stałego lub ciekłego analitu w stan gazowy przy użyciu wiązki laserowej, a następnie nadanie obojętnym cząsteczkom wymaganego ładunku [1]. Wszystkie metody oparte na LDI zalicza się do tzw. metod miękkiej jonizacji, co oznacza, że poddawane badaniu molekuły w głównej mierze przekształcane są w pojedynczo naładowane jony molekularne, a fragmentacji ulegają jedynie w niewielkim stopniu. Techniki LDI są szczególnie atrakcyjne ze względu na dużą czułość oznaczeń (na poziomie femtomolowym), tolerancję na zanieczyszczenia oraz niewielką ilość próbki potrzebną do przeprowadzenia analiz, co w przypadku cennego materiału ogranicza jego straty. W ostatnich latach systemy LDI z powodzeniem znalazły zastosowanie w dziedzinach kryminalistyki i medycyny sądowej jako szybka metoda identyfikacji metabolitów [2].
Techniki LDI umownie dzieli się na :
a) wymagające matrycy, do których zalicza się: MALDI,
b) układy bezmatrycowe tj., SALDI, DIOS.
Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą jest najbardziej znaną i najczęściej stosowaną metodą do badania nielotnych, wielkocząsteczkowych, delikatnych cząsteczek biologicznych. Została ona opracowana pod koniec lat 80 z myślą o śledzeniu zawartości białek, peptydów, węglowodorów i nici DNA. Przebiega przy użyciu niskocząsteczsteczkowego medium zwanego matrycą, która pośredniczy w przekazywaniu energii na badaną substancję, dzięki czemu możliwa jest jej łagodna jonizacja [3].
Klasyczna procedura MALDI rozpoczyna się od powlekania analitu roztworem matrycy. Mieszaninę sporządza się z dużym naddatkiem molowym związku matrycowego (stosunek 1:1000-1:100 000), aby mógł on efektywnie ochronić molekuły przed destruktywnym działaniem promieniowania. Po odparowaniu rozpuszczalnika i współkrystalizacji matrycy i analitu gotową do pomiaru próbkę umieszcza się we wnętrzu spektrometru i poddaje się ją krótkim impulsom lasera [4].
Matryca silnie absorbuje wyemitowane promieniowanie i na skutek powstałej energii termicznej odparowuje z powierzchni razem z analizowaną substancją (desorpcja) [5] . W fazie gazowej dochodzi do dysocjacji matrycy i tworzenia się jonów (głównie H+, Na+, K+), które łączą się z cząsteczkami analitu i matrycy – zachodzi jonizacja. Naładowane cząsteczki są przyspieszane w polu elektrycznym i trafiają do detektora. Cały proces zachodzi w ciągu kilku nanosekund, a na jego jakość i powtarzalność ma wpływ sposób przygotowania próbki [4, 6].
Kierując się wyborem związku, który ma posłużyć w analizie należy wziąć pod uwagę, że matryca powinna spełniać następujące wymogi [6, 8]:
- Izolować cząsteczki analitu i zapobiegać jego agregacji i formowaniu klastrów;
- Wykazywać wysoki stopień absorpcji promieniowania emitowanego przez laser
(UV, IR);
- Być stabilna w warunkach wysokiej próżni;
- Tworzyć z analitem homogeniczną warstwę;
- Łatwo desorbować i umożliwiać szybką, wydajną jonizację;
- Zapewniać niskie tło - dawać sygnały w wartościach m/z nie pokrywających się z miejscem występowania analitu na widmie;
- Być rozpuszczalna w rozpuszczalnikach kompatybilnych z badanym związkiem.
Do tradycyjnych związków matrycowych używanych w MALDI należą substancje organiczne posiadające wysoki współczynnik absorpcji UV, tj. krystaliczne pochodne kwasu benzoesowego (DHB) i cynamonowego (SA, CHCA) oraz jonowe kwasy i zasady [6]. Niektóre z rutynowo wykorzystywanych matryc zostały przedstawione w Tab.1.
Doskonałe zdolności pochłaniania promieniowania są wynikiem posiadania przez matryce reszt chromoforowych. W obecności pierścieni aromatycznych większa część energii zostaje przechwycona przez cząsteczki matrycy, a analit jest zabezpieczony przed niepożądanym rozpadem [4]. Rola matrycy nie kończy się jedynie na ochronie badanego materiału: spełnia również ważne zadanie w jonizacji poprzez przekazywanie energii i dostarczanie jonów potasowych i sodowych [10].
Najczęściej obserwowanymi jonami na widmach MALDI są pojedynczo naładowane dodatnie ([M+H]+, [M+Na]+, [M+K]+) i ujemne jony molekularne [M-H]- , natomiast jony wielokrotnie naładowane typu [M+nH]n+ i [nM+H]+ są spotykane rzadziej. Promowanie występowania jonów jednokrotnie naładowanych jest związane ze zjawiskiem wzajemnej neutralizacji zachodzącym wewnątrz zdesorbowanej mieszaniny matrycy i analitu. Szybkość zobojętnienia jest tym większa im wyższy jest początkowy ładunek jonu, dlatego też cząsteczki o pojedynczym ładunku są mniej podatne na ten proces i mają większe szanse przetrwania. Niekiedy do rozpuszczalnika matrycowego dodaje się związki metali Na+, K+, Cs+ i Ag+ , które dodatkowo stabilizują powstające jony cząsteczkowe [4].
W roku 1995 Sunner i Chen rozwinęli badania nad nieorganicznymi matrycami do analiz metodą LDI. Dostrzegli duży potencjał chemicznie obojętnych cząstek grafitu i wykorzystali je do identyfikacji peptydów i białek. Zapoczątkowali tym samym wdrożenie nanomateriałowych powierzchni w miejsce konwencjonalnych, kłopotliwych matryc organicznych. Tak narodziła się technika SALDI, która znalazła szczególne miejsce w analizie małocząsteczkowych biomolekuł i metabolitów [11].
Nanomateriałami określa się regularne struktury złożone z jednostek nie przekraczających 100 nm. Posiadają one szereg właściwości, które pozwoliły na sprzężenie z LDI [2] :
1. Wysoki współczynnik absorpcji promieniowania lasera;
2. Duży stosunek powierzchni do objętości;
3. Prosta procedura przygotowania próbki;
4. Homogeniczny rozkład analitu;
5. Połączenie z analitem w oparciu o fizyczne i chemiczne powinowactwo;
6. Brak zakłóceń pochodzących od matrycy.
Krystaliczne powierzchnie spełniają taką samą rolę jak matryce w MALDI, ale mechanizmy odpowiadające za desorpcję i jonizację są zgoła inne. W przebiegu SALDI można wstępnie wyróżnić następujące etapy: a) adsorpcja analitu na podłożu, b) pochłonięcie promieniowania lasera przez powierzchnię, c) transfer energii na cząsteczki analitu; d) desorpcja analitu, e) jonizacja w fazie gazowej [11].
Wzbudzenie powierzchni przebiega na zasadzie wytworzenia pary elektron-dziura (półprzewodniki) lub przez zajście powierzchniowego rezonansu plazmonowego, a efektywność zależy od jej budowy morfologicznej, stopnia porowatości oraz wielkości nanocząstek. Po dokonaniu transferu energii istnieje możliwość połączenia się analitu z protonem (jeżeli taki występuje na powierzchni materiału), po czym zjonizowany analit ulega desorpcji. Za źródło czynników protonowych wzbogacających powierzchnię uważa się zaadsorbowane z powietrza węglowodory. W przypadku, gdy nanowarstwa nie posiada związanych donorów protonowych cząsteczki substancji badanej uzyskują ładunek po przejściu w fazę gazową w wyniku kolizji z kationami metali [2]. Oprócz czynników termicznych i stanów elektronowych na jakość procesu desorpcji i jonizacji wpływa także obecność rozpuszczalnika. Dowiedziono, że polarne grupy substancji rozpuszczającej stabilizują molekuły analitu poprzez solwatację i dostarczają dodatkowych protonów. Cząsteczki wody pomagają neutralnym analitom przejść w formę jonową, zwłaszcza gdy proces przebiega na monokrystalicznej warstwie w niskiej temperaturze, natomiast dodatek ciekłego glicerolu poprawia czułość detekcji i zapobiega nadmiernej fragmentacji [12]. Surowce do produkcji nanomateriałowych powierzchni można podzielić na trzy kategorie: węglowe, półprzewodnikowe oraz metaliczne.
Technika ta jest jedną z najczęściej stosowanych metod w identyfikacji peptydów, węglowodorów, kwasów i soli organicznych, związków metaloorganicznych. Stała się także ważnym narzędziem w wykrywaniu nielegalnych narkotyków, np. ecstazy [1].
Porowate płytki krzemowe uzyskuje się na drodze elektrochemicznego wytrawiania krystalicznego krzemu w alkoholowym roztworze kwasu fluorowodorowego. Dostosowanie kształtu, wielkości i głębokości porów jest istotnym zadaniem, gdyż wpływa na przebieg procesu. Optymalne wyniki uzyskuje się przy średnicy porów 50-100 nm i głębokości 400-700 nm [1]. Powstające w wyniku wytrawiania reszty Si-H czynią warstwę silnie hydrofobową i są dobrym źródłem protonów potrzebnych do jonizacji. Niekiedy powłokę poddaje się aktywacji poprzez zastąpienie grup silanowych resztami silanolowymi (Si-OH), które wspomagają jonizację. Porowaty krzem posiada dużą powierzchnię aktywną do łączenia się z analitem i nie generuje sygnałów pochodzących od tła, co stwarza doskonałe warunki do analizy niskocząsteczkowych związków. Podczas eksperymentów zaobserwowano, że materiał wykazuje zdolność do fotoluminescencji [13].
Główną wadą metody jest trwałość materiału. Ugrupowanie znajdujące się na powierzchni są podatne na utlenianie i wrażliwe na zanieczyszczenia, dlatego ich przydatność jest ograniczona do 1 roku od momentu wyprodukowania [15]. Chcąc poprawić stabilność porowatego krzemu konieczne jest wprowadzenie modyfikacji poprzez przyłączenie grup alkenowych bądź alkinowych [1].
Istotą obrazowania jest wizualizacja rozkładu przestrzennego związków pochodzenia biologicznego i syntetycznego w badanym materiale biologicznym [16]. Zestaw danych otrzymany metodą MSI jest wynikiem powiązanych ze sobą składowych, wśród których wyróżniamy: położenie punktu na powierzchni (x,y), stosunek masy do ładunku (m/z) oraz intensywność (I) [17]. Proces sprzężony jest z technikami jonizacji, przy czym najczęściej stosuje się połączenie z MALDI.
Zasadniczo w tej technice można wyróżnić dwa etapy: mapowanie i tworzenie obrazu. Pierwszy z nich polega na zebraniu informacji dotyczących rozmieszczenia analitu w poszczególnych fragmentach materiału badanego [18]. Energia pochodząca z lasera powoduje przejście cząsteczek biologicznych w stan gazowy, gdzie ulegają jonizacji i rozdzielane są zgodnie z ich stosunkiem m/z w spektrometrze masowym. Do separacji zjonizowanych cząstek najczęściej stosuje się analizator czasu przelotu ToF (ang. Time of Flight) [19].
W wyniku stopniowego przemieszczania się lasera po tkance zbierane są widma masowe - uzyskuje się tysiące punktów pomiarowych w postaci plam, które zawierają sygnały analizowanych związków o różnej intensywności. Na etapie obrazowania informacje z przeskanowanej tkanki poddawane są obróbce komputerowej i zostają przekształcone w przejrzystą, graficzną formę [18].
Niezwykle atrakcyjnym aspektem obrazowania jest jego efektywność. Już podczas jednego eksperymentu jesteśmy w stanie uzyskać szczegółowe, rzetelne informacje na temat lokalizacji cząsteczek, istniejących modyfikacji potranslacyjnych, a także ustalić skład ilościowy danego związku [20]. Doskonała czułość pozwala na wykrywanie substancji na poziomie femtomolowym (10-15 mola), a więc potwierdza nawet śladową obecność cząsteczek. W porównaniu z innymi metodami obrazowania, MSI nie wymaga uprzednich kroków związanych ze żmudnym oczyszczaniem i separacją. Dodatkowym atutem przemawiającym na korzyść tej metody jest możliwość analizy bez konieczności stosowania radioaktywnych znaczników fluorescencyjnych czy immunochemicznych reagentów, co wpływa pozytywnie na oszczędność czasu i redukcję kosztów przeprowadzanych badań [6].
Metoda MSI stała się potężnym narzędziem wykorzystywanym w analizie złożonych układów biologicznych takich jak pojedyncze komórki czy tkanki w środowisku in vivo, in vitro i in situ. Obrazowanie w obrębie tych struktur pozwala na identyfikację związków o różnym pochodzeniu tj. leków, metabolitów, węglowodanów, białek, peptydów, lipidów a także polimerów, co jest osiągalne poprzez możliwość analizy w szerokim zakresie mas rozpoczynając od atomów i substancji niskocząsteczkowych po duże makromolekuły. W zasadzie przy pomocy obrazowania można wykryć setki różnych substancji w wysokiej rozdzielczości przy zachowaniu stosunkowo dużej wydajności [7] Technika powala również na bardziej zaawansowane badania dotyczące rozpoznania i śledzenia miejsc zmienionych nowotworowo, a także oceny postępów zastosowanej terapii [21].
Metody LDI sprzężone ze spektrometrią mas z powodzeniem znajdują zastosowanie w badaniu budowy i występowania syntetycznych związków chemicznych i molekuł wchodzących w skład złożonych układów biologicznych tj. tkanki, krew, osocze, mocz. Ze względu na nieinwazyjność i wysoką skuteczność wykorzystywane są do analiz w następujących dziedzinach:
- biochemia – ustalanie mas cząsteczkowych peptydów, białek, oligonukleotydów, odtworzenie sekwencji aminokwasów w łańcuchach DNA;
- mikrobiologia – identyfikacja bakterii i grzybów;
- medycyna – poszukiwanie biomarkerów, obrazowanie tkankowe; śledzenie dystrybucji i procesów metabolicznych leków;
- chemia polimerów – badanie struktury i czystości związków polimerowych.
201 anonymous users oraz 0 registered users online.
Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.
Konferencja: “KrakWet” – postępy w naukach weterynaryjnych i biotechnologii zwierząt, 27 lutego 2020 roku, Kraków
Konferencja: „Pierwotne i wtórne metabolity roślin i grzybów”, 28 lutego 2020 roku, Kraków
Konferencja: Neuronus IBRO Neuroscience Forum 2020, 24-26 kwietnia 2020 roku, Kraków
Konferencja: III Ogólnopolska Konferencja Naukowa IMPLANTY 2020, 18-19 czerwca 2020 roku, Gdańsk
Młodszy Specjalista ds. patentów, miejsce pracy: Warszawa
