biotechnologia


 
 

Metody laserowej desorpcji/jonizacji - LDI

Autor: Anna Czerniecka

Spektrometria mas jest techniką analityczną, która w ciągu ostatniego stulecia uległa dynamicznemu rozwojowi. Począwszy od skonstruowania pierwszego spektrometru przez Josepha Johna Thomsona w 1911 roku do czasów współczesnych przeszła długą drogę doskonalenia, dzięki czemu dziś jest cenioną techniką pozwalającą na identyfikację związków chemicznych oraz precyzyjne określenie składu złożonych struktur. Do zasadniczego postępu w tym kierunku przyczyniło się powstanie nowych metod łagodnej jonizacji próbek biologicznych, które znalazły zastosowanie w proteomice, metabolomice oraz chemii materiałów i polimerów. Imponujące osiągnięcia w metodach LDI dostarczyły nowych możliwości w dziedzinie obrazowania tkanek biologicznych, co przyczyniło się do pogłębienia wiedzy na temat ich funkcjonowania, a także pomogło w zrozumieniu procesów patofizjologicznych.

Techniki LDI wykorzystujące proces transferu energii zostały wprowadzone w późnych latach 60 ubiegłego wieku jako obiecująca perspektywa badania biocząsteczek umiejscowionych na powierzchni płytki. Istotą tego mechanizmu jest wprowadzenie stałego lub ciekłego analitu w stan gazowy przy użyciu wiązki laserowej, a następnie nadanie obojętnym cząsteczkom wymaganego ładunku [1]. Wszystkie metody oparte na LDI zalicza się do tzw. metod miękkiej jonizacji, co oznacza, że poddawane badaniu molekuły w głównej mierze przekształcane są w pojedynczo naładowane jony molekularne, a fragmentacji ulegają jedynie w niewielkim stopniu. Techniki LDI są szczególnie atrakcyjne ze względu na dużą czułość oznaczeń (na poziomie femtomolowym), tolerancję na zanieczyszczenia oraz niewielką ilość próbki potrzebną do przeprowadzenia analiz, co w przypadku cennego materiału ogranicza jego straty. W ostatnich latach systemy LDI z powodzeniem znalazły zastosowanie w dziedzinach kryminalistyki i medycyny sądowej jako szybka metoda identyfikacji metabolitów [2].

Techniki LDI umownie dzieli się na :
a) wymagające matrycy, do których zalicza się: MALDI,
b) układy bezmatrycowe tj., SALDI, DIOS.


1. MALDI (ang. Matrix- assisted laser desorption/ionization) - laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą

Laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana matrycą jest najbardziej znaną i najczęściej stosowaną metodą do badania nielotnych, wielkocząsteczkowych, delikatnych cząsteczek biologicznych. Została ona opracowana pod koniec lat 80 z myślą o śledzeniu zawartości białek, peptydów, węglowodorów i nici DNA. Przebiega przy użyciu niskocząsteczsteczkowego medium zwanego matrycą, która pośredniczy w przekazywaniu energii na badaną substancję, dzięki czemu możliwa jest jej łagodna jonizacja [3].

Klasyczna procedura MALDI rozpoczyna się od powlekania analitu roztworem matrycy. Mieszaninę sporządza się z dużym naddatkiem molowym związku matrycowego (stosunek 1:1000-1:100 000), aby mógł on efektywnie ochronić molekuły przed destruktywnym działaniem promieniowania. Po odparowaniu rozpuszczalnika i współkrystalizacji matrycy i analitu gotową do pomiaru próbkę umieszcza się we wnętrzu spektrometru i poddaje się ją krótkim impulsom lasera [4].


Rys.1. Przygotowanie próbki do MALDI, po lewej: nanoszenie na płytkę roztworu analitu i matrycy; po prawej: efekt wzajemnej kokrystalizacji [4].

Matryca silnie absorbuje wyemitowane promieniowanie i na skutek powstałej energii termicznej odparowuje z powierzchni razem z analizowaną substancją (desorpcja) [5] . W fazie gazowej dochodzi do dysocjacji matrycy i tworzenia się jonów (głównie H+, Na+, K+), które łączą się z cząsteczkami analitu i matrycy – zachodzi jonizacja. Naładowane cząsteczki są przyspieszane w polu elektrycznym i trafiają do detektora. Cały proces zachodzi w ciągu kilku nanosekund, a na jego jakość i powtarzalność ma wpływ sposób przygotowania próbki [4, 6].


Rys.2. Schemat przedstawiający przebieg procesu MALDI [7].

1.1 Matryce w MALDI

Kierując się wyborem związku, który ma posłużyć w analizie należy wziąć pod uwagę, że matryca powinna spełniać następujące wymogi [6, 8]:
- Izolować cząsteczki analitu i zapobiegać jego agregacji i formowaniu klastrów;
- Wykazywać wysoki stopień absorpcji promieniowania emitowanego przez laser (UV, IR);
- Być stabilna w warunkach wysokiej próżni;
- Tworzyć z analitem homogeniczną warstwę;
- Łatwo desorbować i umożliwiać szybką, wydajną jonizację;
- Zapewniać niskie tło - dawać sygnały w wartościach m/z nie pokrywających się z miejscem występowania analitu na widmie;
- Być rozpuszczalna w rozpuszczalnikach kompatybilnych z badanym związkiem.

Do tradycyjnych związków matrycowych używanych w MALDI należą substancje organiczne posiadające wysoki współczynnik absorpcji UV, tj. krystaliczne pochodne kwasu benzoesowego (DHB) i cynamonowego (SA, CHCA) oraz jonowe kwasy i zasady [6]. Niektóre z rutynowo wykorzystywanych matryc zostały przedstawione w Tab.1.


Tab.1 Popularne matryce używane w obrazowaniu MALDI [9].


Doskonałe zdolności pochłaniania promieniowania są wynikiem posiadania przez matryce reszt chromoforowych. W obecności pierścieni aromatycznych większa część energii zostaje przechwycona przez cząsteczki matrycy, a analit jest zabezpieczony przed niepożądanym rozpadem [4]. Rola matrycy nie kończy się jedynie na ochronie badanego materiału: spełnia również ważne zadanie w jonizacji poprzez przekazywanie energii i dostarczanie jonów potasowych i sodowych [10].


1.2 Rodzaje jonów

Najczęściej obserwowanymi jonami na widmach MALDI są pojedynczo naładowane dodatnie ([M+H]+, [M+Na]+, [M+K]+) i ujemne jony molekularne [M-H]- , natomiast jony wielokrotnie naładowane typu [M+nH]n+ i [nM+H]+ są spotykane rzadziej. Promowanie występowania jonów jednokrotnie naładowanych jest związane ze zjawiskiem wzajemnej neutralizacji zachodzącym wewnątrz zdesorbowanej mieszaniny matrycy i analitu. Szybkość zobojętnienia jest tym większa im wyższy jest początkowy ładunek jonu, dlatego też cząsteczki o pojedynczym ładunku są mniej podatne na ten proces i mają większe szanse przetrwania. Niekiedy do rozpuszczalnika matrycowego dodaje się związki metali Na+, K+, Cs+ i Ag+ , które dodatkowo stabilizują powstające jony cząsteczkowe [4].


2. SALDI - (ang. surface assisted laser desorption/ionization) - laserowa desorpcja/jonizacja wspomagana powierzchnią

W roku 1995 Sunner i Chen rozwinęli badania nad nieorganicznymi matrycami do analiz metodą LDI. Dostrzegli duży potencjał chemicznie obojętnych cząstek grafitu i wykorzystali je do identyfikacji peptydów i białek. Zapoczątkowali tym samym wdrożenie nanomateriałowych powierzchni w miejsce konwencjonalnych, kłopotliwych matryc organicznych. Tak narodziła się technika SALDI, która znalazła szczególne miejsce w analizie małocząsteczkowych biomolekuł i metabolitów [11].

Nanomateriałami określa się regularne struktury złożone z jednostek nie przekraczających 100 nm. Posiadają one szereg właściwości, które pozwoliły na sprzężenie z LDI [2] :
1. Wysoki współczynnik absorpcji promieniowania lasera;
2. Duży stosunek powierzchni do objętości;
3. Prosta procedura przygotowania próbki;
4. Homogeniczny rozkład analitu;
5. Połączenie z analitem w oparciu o fizyczne i chemiczne powinowactwo;
6. Brak zakłóceń pochodzących od matrycy.

Krystaliczne powierzchnie spełniają taką samą rolę jak matryce w MALDI, ale mechanizmy odpowiadające za desorpcję i jonizację są zgoła inne. W przebiegu SALDI można wstępnie wyróżnić następujące etapy: a) adsorpcja analitu na podłożu, b) pochłonięcie promieniowania lasera przez powierzchnię, c) transfer energii na cząsteczki analitu; d) desorpcja analitu, e) jonizacja w fazie gazowej [11].


Rys.3 Przebieg procesu SALDI MS [14].

Wzbudzenie powierzchni przebiega na zasadzie wytworzenia pary elektron-dziura (półprzewodniki) lub przez zajście powierzchniowego rezonansu plazmonowego, a efektywność zależy od jej budowy morfologicznej, stopnia porowatości oraz wielkości nanocząstek. Po dokonaniu transferu energii istnieje możliwość połączenia się analitu z protonem (jeżeli taki występuje na powierzchni materiału), po czym zjonizowany analit ulega desorpcji. Za źródło czynników protonowych wzbogacających powierzchnię uważa się zaadsorbowane z powietrza węglowodory. W przypadku, gdy nanowarstwa nie posiada związanych donorów protonowych cząsteczki substancji badanej uzyskują ładunek po przejściu w fazę gazową w wyniku kolizji z kationami metali [2]. Oprócz czynników termicznych i stanów elektronowych na jakość procesu desorpcji i jonizacji wpływa także obecność rozpuszczalnika. Dowiedziono, że polarne grupy substancji rozpuszczającej stabilizują molekuły analitu poprzez solwatację i dostarczają dodatkowych protonów. Cząsteczki wody pomagają neutralnym analitom przejść w formę jonową, zwłaszcza gdy proces przebiega na monokrystalicznej warstwie w niskiej temperaturze, natomiast dodatek ciekłego glicerolu poprawia czułość detekcji i zapobiega nadmiernej fragmentacji [12]. Surowce do produkcji nanomateriałowych powierzchni można podzielić na trzy kategorie: węglowe, półprzewodnikowe oraz metaliczne.


3. DIOS (ang. desorption/ionization on silicon) - Desorpcja/jonizacja z krzemu porowatego

Technika ta jest jedną z najczęściej stosowanych metod w identyfikacji peptydów, węglowodorów, kwasów i soli organicznych, związków metaloorganicznych. Stała się także ważnym narzędziem w wykrywaniu nielegalnych narkotyków, np. ecstazy [1].

Porowate płytki krzemowe uzyskuje się na drodze elektrochemicznego wytrawiania krystalicznego krzemu w alkoholowym roztworze kwasu fluorowodorowego. Dostosowanie kształtu, wielkości i głębokości porów jest istotnym zadaniem, gdyż wpływa na przebieg procesu. Optymalne wyniki uzyskuje się przy średnicy porów 50-100 nm i głębokości 400-700 nm [1]. Powstające w wyniku wytrawiania reszty Si-H czynią warstwę silnie hydrofobową i są dobrym źródłem protonów potrzebnych do jonizacji. Niekiedy powłokę poddaje się aktywacji poprzez zastąpienie grup silanowych resztami silanolowymi (Si-OH), które wspomagają jonizację. Porowaty krzem posiada dużą powierzchnię aktywną do łączenia się z analitem i nie generuje sygnałów pochodzących od tła, co stwarza doskonałe warunki do analizy niskocząsteczkowych związków. Podczas eksperymentów zaobserwowano, że materiał wykazuje zdolność do fotoluminescencji [13].


Rys.4 Schemat procesu DIOS [51].

Główną wadą metody jest trwałość materiału. Ugrupowanie znajdujące się na powierzchni są podatne na utlenianie i wrażliwe na zanieczyszczenia, dlatego ich przydatność jest ograniczona do 1 roku od momentu wyprodukowania [15]. Chcąc poprawić stabilność porowatego krzemu konieczne jest wprowadzenie modyfikacji poprzez przyłączenie grup alkenowych bądź alkinowych [1].


Obrazowanie tkanek zwierzęcych przy pomocy spektrometrii mas MSI (ang. mass spectrometry imaging)

Istotą obrazowania jest wizualizacja rozkładu przestrzennego związków pochodzenia biologicznego i syntetycznego w badanym materiale biologicznym [16]. Zestaw danych otrzymany metodą MSI jest wynikiem powiązanych ze sobą składowych, wśród których wyróżniamy: położenie punktu na powierzchni (x,y), stosunek masy do ładunku (m/z) oraz intensywność (I) [17]. Proces sprzężony jest z technikami jonizacji, przy czym najczęściej stosuje się połączenie z MALDI.

Zasadniczo w tej technice można wyróżnić dwa etapy: mapowanie i tworzenie obrazu. Pierwszy z nich polega na zebraniu informacji dotyczących rozmieszczenia analitu w poszczególnych fragmentach materiału badanego [18]. Energia pochodząca z lasera powoduje przejście cząsteczek biologicznych w stan gazowy, gdzie ulegają jonizacji i rozdzielane są zgodnie z ich stosunkiem m/z w spektrometrze masowym. Do separacji zjonizowanych cząstek najczęściej stosuje się analizator czasu przelotu ToF (ang. Time of Flight) [19].

W wyniku stopniowego przemieszczania się lasera po tkance zbierane są widma masowe - uzyskuje się tysiące punktów pomiarowych w postaci plam, które zawierają sygnały analizowanych związków o różnej intensywności. Na etapie obrazowania informacje z przeskanowanej tkanki poddawane są obróbce komputerowej i zostają przekształcone w przejrzystą, graficzną formę [18].


Rys.5 Schemat przebiegu obrazowania z wykorzystaniem techniki MALDI [16]

Niezwykle atrakcyjnym aspektem obrazowania jest jego efektywność. Już podczas jednego eksperymentu jesteśmy w stanie uzyskać szczegółowe, rzetelne informacje na temat lokalizacji cząsteczek, istniejących modyfikacji potranslacyjnych, a także ustalić skład ilościowy danego związku [20]. Doskonała czułość pozwala na wykrywanie substancji na poziomie femtomolowym (10-15 mola), a więc potwierdza nawet śladową obecność cząsteczek. W porównaniu z innymi metodami obrazowania, MSI nie wymaga uprzednich kroków związanych ze żmudnym oczyszczaniem i separacją. Dodatkowym atutem przemawiającym na korzyść tej metody jest możliwość analizy bez konieczności stosowania radioaktywnych znaczników fluorescencyjnych czy immunochemicznych reagentów, co wpływa pozytywnie na oszczędność czasu i redukcję kosztów przeprowadzanych badań [6].

Metoda MSI stała się potężnym narzędziem wykorzystywanym w analizie złożonych układów biologicznych takich jak pojedyncze komórki czy tkanki w środowisku in vivo, in vitro i in situ. Obrazowanie w obrębie tych struktur pozwala na identyfikację związków o różnym pochodzeniu tj. leków, metabolitów, węglowodanów, białek, peptydów, lipidów a także polimerów, co jest osiągalne poprzez możliwość analizy w szerokim zakresie mas rozpoczynając od atomów i substancji niskocząsteczkowych po duże makromolekuły. W zasadzie przy pomocy obrazowania można wykryć setki różnych substancji w wysokiej rozdzielczości przy zachowaniu stosunkowo dużej wydajności [7] Technika powala również na bardziej zaawansowane badania dotyczące rozpoznania i śledzenia miejsc zmienionych nowotworowo, a także oceny postępów zastosowanej terapii [21].

Metody LDI sprzężone ze spektrometrią mas z powodzeniem znajdują zastosowanie w badaniu budowy i występowania syntetycznych związków chemicznych i molekuł wchodzących w skład złożonych układów biologicznych tj. tkanki, krew, osocze, mocz. Ze względu na nieinwazyjność i wysoką skuteczność wykorzystywane są do analiz w następujących dziedzinach:
- biochemia – ustalanie mas cząsteczkowych peptydów, białek, oligonukleotydów, odtworzenie sekwencji aminokwasów w łańcuchach DNA;
- mikrobiologia – identyfikacja bakterii i grzybów;
- medycyna – poszukiwanie biomarkerów, obrazowanie tkankowe; śledzenie dystrybucji i procesów metabolicznych leków;
- chemia polimerów – badanie struktury i czystości związków polimerowych.


Literatura:
1. P. A. Kuzema, Small Molecule Analysis by Surface Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry (2011). Journal of Analytical Chemistry, 66: 1227–1242.
2. A. Y. Lim , J. Ma , Y. F. Boey Development of Nanomaterials for SALDI-MS Analysis in Forensics (2012). Advanced Materials, 24: 4211–4216
3. P. J. Quinn, X. Wang (ed.), Lipids in Health and Disease. Springer Science+Business Media B.V. (2008)
4. J. H. Gross Mass spectrometry. Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2004, 2011.
5. F. Hillenkamp, J. Peter-Katalinic´ MALDI MS: A Practical Guide to Instrumentation, Methods and Applications. Wiley-VCH Verlag GmvH & Co. KGaA, Weinheim (2007).
6. M.Setou (Ed.), Imaging Mass spectrometry. Protocols for Mass microscopy. Springer Japan (2008).
7. S.S Rubakhin, J.V. Sweedler A Mass Spectrometry Primer for Mass Spectrometry Imaging (2010). Methods in Molecular Biology; 656: 21-49.
8. B. Fuchs, R. Süß, J. Schiller An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research (2010). Progress in Lipid Research, 49: 450–475.
9. B. K. Kaletas I. M. van der Wiel, J. Stauber, L. J. Dekker, C. Guzel, J. M. Kros, T. M. Luider , R. M. A. Heeren, Sample preparation issues for tissue imaging by imaging MS (2009). Proteomics; 9: 2622–2633.
10. J. K. Lewis, J. Wei, Gary Siuzdak, Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Analysis (2000). John Wiley & Sons Ltd, 5880 – 5894.
11. K. P. Law, J. R. Larkin Recent advances in SALDI-MS techniques and their chemical and bioanalytical applications (2011). Analytical and Bioanalytical Chemistry; 399: 2597–2622.
12. Z. Guo, A. A. A. Ganawi, Q. Liu, L. He, Nanomaterials in mass spectrometry ionization and prospects for biological application, (2006). Analytical and Bioanalytical Chemistry; 384: 584– 592.
13. W. G. Lewis, Z. Shen, M.G. Finn, G. Siuzdak, Desorption/ionization on silicon (DIOS) mass spectrometry: background and applications (2003). International Journal of Mass Spectrometry; 226: 107–116
14. Y. E. Silina, D. A. Volmer Nanostructured solid substrates for efficient laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) of low molecular weight compounds (2013). The Royal Society of Chemistry; 138: 7053–7065.
15. M. Rainer, M. N. Qureshi, G. K. Bonn, Matrix-free and material-enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry for the analysis of low molecular weight compounds, (2011). Analytical and Bioanalytical Chemistry; 400: 2281- 2288
16. P. Chaurand, Imaging mass spectrometry of thin tissue sections :A decade of collective efforts (2012). Journal of proteomics; 75: 4883 – 4892.
17. A. Svatos, Mass spectrometric imaging of small molecules (2010). Trends in Biotechnology, (2010) 28: 425–434.
18. Ch. Dass, Fundamentals of Contemporary Mass Spectrometry. John Wiley & Sons Inc, Hoboken, New Jersey (2007)
19. L. A. McDonnell, R.M.A. Heeren, Imaging mass spectrometry (2007). Mass Spectrometry Reviews; 26: 606-643.
20. S. A. Schwartz, R. M. Caprioli, Imaging Mass Spectrometry: Viewing the Future (2010). Methods in Molecular Biology; 656: 3-19
21. J. H. Jungmann, R.M.A. Heeren. Emerging technologies in mass spectrometry imaging (2012). Journal of Proteomics; 75:5077 – 5092


Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

337 anonymous users oraz 0 registered users online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Dla pasjonatów

Koszulki, bluzy, kubki, plecaki i in.


Oferty pracy

Facebook

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u