biobiobio


 

Mikroiniekcja

Postępujący rozwój biotechnologii i technik biologii molekularnej dają możliwość stosowania coraz to bardziej zaawansowanych metod badawczych, jak również wykorzystywania komórek w hodowlach in vitro. Wprowadzanie do wnętrza komórek kwasów nukleinowych, czy białek umożliwia zarówno określenie właściwości biochemicznych komórek – struktury i funkcji genów, analizę ekspresji genów, aktywności sekwencji regulatorowych za pomocą genów reporterowych, jak i wykorzystanie komórek jako bioreaktora dla uzyskiwania określonego bioproduktu.
Dzięki umieszczeniu w komórce kwasów nukleinowych możemy określać funkcje genów poprzez analizę ich ekspresji, jak i uzyskiwać organizmy modyfikowane genetycznie, które produkują w ten sposób ze zwiększoną intensywnością pożądany metabolit, lub wykazują zupełnie nowe cechy.
Metodami fizycznymi wprowadzania biomolekuł do komórek nazwać można te, w których nie występuje żaden związek chemiczny, który umożliwiał, lub ułatwiałby proces wprowadzania. Cząsteczki dostają się do wnętrza komórki tylko dzięki oddziaływaniom fizycznym, mechanicznym, elektrycznym czy dyfuzyjnym. Do tej grupy metod zaliczyć można:

mikroiniekcję,
elektroporację,
mikrowstrzeliwanie.


Mikroiniekcja

Metoda polegająca na bezpośrednim wstrzyknięciu za pomocą cienkiej szklanej igły materiału do wnętrza komórki docelowej. Komórka do której wprowadzone mają zostać cząsteczki zostaje unieruchomiona na pipecie pomocniczej, a za pomocą szklanej, ostro zakończonej igły o średnicy od 0,5 do 5 μm przebita zostaje błona komórkowa i materiał zostaje wtłoczony do wnętrza komórki. Technika ta umożliwia ponadto bezpośrednie umieszczenie materiału w jądrze komórkowym, co ma szczególne znaczenie przy wprowadzaniu DNA. Możliwa jest wtedy integracja transgenów z genomem komórki.
Transfer genów między organizmami pozwala na produkcję dużych ilości białek. Wykorzystywany jest także w produkcji enzymów stosowanych w przemyśle. Integrację transfer genów wykorzystuje się również do tworzenia organizmów zmodyfikowanych genetycznie takich jak rośliny, zwierzęta i mikroorganizmy.


Metoda wykonania

Mikroiniekcja może być wykonywana za pomocą specjalnego mikromanipulatora połączonego z odwróconym mikroskopem. Hydrauliczne połączenie ze strzykawką umożliwia bardzo precyzyjne ruchy ograniczając do minimum ryzyko uszkodzenia komórki. Istnieją trzy systemy aparaturowe do prowadzenia mikroiniekcji:
• Manualny w którym zarówno położenie pipety, jak i ciśnienie konieczne do wstrzyknięcia substancji wprowadzanej obsługiwane jest ręcznie. System jest sprzężony z pojedynczą strzykawką.
• Półautomatyczny – w którym nadal konieczne jest ręczne naprowadzanie igły na komórkę, jednakże wartość ciśnienia i czas iniekcji kontrolowany jest automatycznie poprzez pojedynczy przycisk, na podstawie określonych wartości.
• Układ automatyczny – komórki mogą zostać immobilizowane w określonych punktach matrycy, określone zostają punkty startu natomiast iniekcja zostaje przeprowadzona za pomocą mikrorobotów. System podlega kontroli komputera, który przemieszcza strzykawkę w odpowiednie miejsca na matrycy dokonując iniekcji.


Skuteczność mikroiniekcji

Mikroiniekcja jest kontrolowana z poziomu komputera, uzyskując przy tym bardzo wysoką wydajność. Możliwe jest nakłuwanie 15 embrionów na minutę, przy 99% skuteczności i 98% przeżywalności. Oczywiście koszt prowadzenia eksperymentu wzrasta wraz ze wzrostem automatyzacji procesu.
Do zalet mikroiniekcji zaliczyć należy oszczędność wprowadzanego materiału, ponieważ wystarczą objętości rzędów 10-12– 10-15 litra na komórkę. Ponadto technika ta charakteryzuje się niskim stopniem uszkodzenia komórek, nie odnotowuje się odpowiedzi wynikających ze stresu komórki jak ma to miejsce w przypadku innych technik. Nie ma ograniczeń co do wprowadzonego materiału, a zatem metoda ta może być stosowana do wprowadzania zarówno dużych i małych białek, oraz kwasów nukleinowych.


Podsumowanie

Mikroiniekcja jest techniką która wykorzystywana była do analizy cytometrycznej białek mikroszkieletu – aktyny, miozyny, tubuliny, ale przede znalazła zastosowanie w procesie iniekcji DNA do oocytów w celu uzyskiwania organizmów modyfikowanych genetycznie, oraz w celu zapłodnienia in vitro.


Rys. Mikroiniekcja DNA

Karolina Bombolewska


Literatura:
1. Gordon J. W., Scangos G.A., Plotkin D.J., Barbosa .JA., Ruddle F.H., 1980. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. PNAS, 7380-7384.
2. Węgleński P., Bębas P., 2006. Genetyka molekularna. Wydawnictwo Naukowe PWN, 109-163.
3. Buchowicz J., 2009. Biotechnologia molekularna – Modyfikacje genetyczne, postępy, problem. Wydawnictwo Naukowe PWN.
4. P.C. Winter P.C., G.I. Hickey G.I., H.L. Fletcher H.L., 2008. Genetyka. Krótkie wykłady. Wydawnictwo Naukowe PWN.
5. http://www.wormbook.org
6. http://www.pnas.org/


Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Menu podręczne

Kto jest online

43 anonymous users oraz 0 registered users online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem. Tutaj możesz się zalogować.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły.

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2013 e-biotechnologia.pl
stat4u