biotechnologia


 
 

Mikroorganizmy VBNC

Autor: Izabela Podgórska
Uniwersytet Przyrodniczy

VBNC (ang. viable but not culturable) to mikroorganizmy, których nie można namnożyć i hodować w warunkach laboratoryjnych na klasycznych podłożach mikrobiologicznych.

Zjawisko to dotyczy nie tylko izolatów ze środowiska naturalnego, ale również patogenów człowieka. Nazwa VBNC została po raz pierwszy użyta w 1982 r., natomiast jej trafność potwierdzają współczesne osiągnięcia technologiczne umożliwiające detekcję materiału genetycznego mikroorganizmów bez konieczności hodowli. Ostatnie 10 lat badań wskazuje jednak, że formy VBNC to nie tylko unikalna cecha poszczególnych gatunków, ale jest to stan fizjologiczny (fenotyp), który mikroorganizm może osiągnąć w następstwie niesprzyjających warunków środowiska. Czynnikami promującymi wejście bakterii w stan VBNC są np.: niedobór składników odżywczych, wahania temperatury, pH, zasolenia, dostępności tlenu, a także promieniowanie czy działanie subletalnych dawek różnych związków chemicznych. Niestety zjawisko takie zostało opisane również dla patogenów człowieka, a czynnikiem promującym przejście w stan VBNC może być m. in. antybiotykoterapia. VBNC jest to stan przejściowy, z którego dany mikroorganizm może powrócić do formy hodowlanej na drodze tzw. resuscytacji, w obecności czynników sprzyjających wzrostowi. Zdolność powrotu mikroorganizmów VBNC do formy wegetatywnej zależy od stopnia intensywności zmian postępujących w komórce oraz od długości okresu przebywania w takim stanie, gdyż przekroczenie pewnej granicy może doprowadzić do rozpadu komórki zamiast do jej reaktywacji.

Mikroorganizmy VBNC zaliczamy do jednej z trzech grup:
1. Obligatoryjne symbionty lub pasożyty niezdolne do wzrostu na podłożach mikrobiologicznych
2. Znane gatunki, w identyfikacji których metody hodowlane okazują się nieodpowiednie
3. Nieznane gatunki, które nigdy wcześniej nie były hodowane w związku z brakiem odpowiednich metod


Patogeny człowieka

Formy VBNC różnią się od form hodowlanych pod względem morfologii komórki, budowy błony i ściany komórkowej, odporności na stres chemiczny i fizyczny, a także pod względem metabolizmu, ekspresji genów czy zdolności do wirulencji. VBNC nie są komórkami martwymi i wciąż pozostają aktywne metabolicznie oraz przeprowadzają transkrypcję, jednak jest to w dużej mierze metabolizm uśpiony. Komórki w stadium VBNC wykazują obniżoną aktywność fizjologiczną i metaboliczną. Następuje u nich synteza białek i modyfikacja ich składu na korzyść tzw. białek głodowych (ang. starvation proteins) i szoku termicznego (tzw. chaperonów), które zwiększają oporność na niekorzystne warunki. Dochodzi także do utraty spójności błony cytoplazmatycznej, która powoli ulega pęknięciom oraz podlega zmianom składu kwasów tłuszczowych. W celu podtrzymania potencjału membranowego obserwuje się również obniżenie transportu aktywnego i aktywności respiracyjnej. Komórki w stanie VBNC mogą mieć zmienione kształty, może dochodzić do ich miniaturyzacji, znacznego wydłużenia lub przechodzenia w formę kulistą. Kierunek zmian jest niejednoznaczny, zależy indywidualnie od szczepu i rodzaju czynnika stresującego, który te zmiany wywołuje. Niektóre szczepy mikroorganizmów zachowują zdolność do wirulencji jako formy VBNC, co jest dużym problemem z punktu widzenia klinicznego, ponieważ infekcji tego typu nie można zdiagnozować używając standardowych procedur. Przykłady patogenów człowieka o udowodnionej zdolności przechodzenia w stan VBNC przedstawiono w tabeli 1.


Patogen

Induktor przejścia w stan VBNC

Warunki resuscytacji

Czas resuscytacji

Aerobacter butzleri Wyczerpanie składników odżywczych Bogate podłoże hodowlane 270 dni
Bacillus cereus Pulsacyjne pole elektryczne Brak danych   Brak danych
Campylobacter jejuni Wyczerpanie składników odżywczych, niskie pH, niska temperatura Bogate podłoże hodowlane 15 dni
Citrobacter freundi Wyczerpanie składników odżywczych, wysoka temperatura Bogate podłoże hodowlane 11 lat
Enterococcus faecium Wyczerpanie składników odżywczych, wysoka temperatura Bogate podłoże hodowlane 7 dni
Escherichia coli Wyczerpanie składników odżywczych, światło, stres oksydacyjny, wysoka temperatura, chlorowanie Bogate podłoże hodowlane, podłoże minimalne z dostępnością aminokwasów, Brak danych
Micrococcus luteus Wyczerpanie składników odżywczych Bogate podłoże hodowlane 6 miesięcy
Mycobacterium tuberculosis Wyczerpanie składników odżywczych, ograniczenie dostępu tlenu Bogate podłoże hodowlane z katalazą 3,5 miesiąca
Vibrio fluvialis Wyczerpanie składników odżywczych Bogate podłoże hodowlane 6 lat

Jednym z lepiej opisanych patogenów VBNC jest Mycobacterium tuberculosis, dla którego czas resuscytacji wynosi około 3,5 miesiąca. W przypadku tego patogenu stan VBNC nazywany jest stanem latencji lub uśpienia, który dotyczy ponad 2 milionów nosicieli na świecie. Innym istotnym z klinicznego punktu widzenia patogenem człowieka jest Staphylococcus ureus, którego induktorem przejścia w stan VBNC jest stosowanie antybiotyków. Stosowanie nieodpowiednich antybiotyków, niezgodnie z zaleceniami lekarza, przyspiesza przekształcenie w formę niehodowaną w warunkach laboratoryjnych, co stanowi ogromny problem w kontekście zdrowia publicznego. Formy takie, ze względu na spowolniony metabolizm, są w naturalny sposób bardziej oporne na stosowane antybiotyki. Dlatego też obecność form VBNC stwarza ogromny problem nie tylko ich detekcji, ale także zastosowania odpowiedniej i skutecznej terapii.


Jak wykrywać mikroorganizmy VBNC?

Brak odpowiednich metod wykrywania patogenów w stanie VBNC zwiększa ryzyko narażenia ludzi na spożycie zanieczyszczonej żywności czy wody. W związku z tym, w celu sprawdzenia poziomu zanieczyszczeń mikrobiologicznych bardzo ważne, aby wykorzystać odpowiednie techniki do wykrywania bakterii VBNC i ustalenia ich żywotności. Pierwszym etapem badań mikroorganizmów VBNC jest oddzielenie komórek, które można hodować w warunkach laboratoryjnych na podłożu mikrobiologicznym, od tych które nie dają się hodować. Wśród tych drugich należy rozróżnić patogeny VBNC od martwych komórek, czemu służy szereg testów z użyciem barwników fluorescencyjnych, reakcji enzymatycznych z wykorzystaniem soli tetrazolowych, pomiary potencjału membranowego, poziomu pH wewnątrz komórek, czy wykonanie testu na obecność ATP. Alternatywą dla testów hodowlanych jest metoda wykrywania ekspresji genów za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Ze względu na krótki czas połowicznego rozpadu mRNA, sygnał dodatni wskazuje na obecność mRNA, a zatem obecność żywych komórek, które dokonują transkrypcji.



Detekcji komórek VBNC w środowisku można dokonać także metodą „gfp-tagging” poprzez wprowadzenie do materiału genetycznego badanej bakterii genu gfp pobranego z bakterii E. coli. Zielone białko florescencyjne GFP (ang. green fluorescent protein) kodowane przez gen gfp jest powszechnie stosowanym białkiem reporterowym, umożliwiającym monitorowanie ekspresji genu, a także lokalizację białka GFP w komórkach. Po ekspresji genu komórki transformowane produkują białko GFP, które można oznaczać ilościowo metodą fluorometryczną lub dokonać obserwacji z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego.


Podsumowanie

Mikroorganizmy VBNC są uważane za zagrożenie dla zdrowia publicznego i bezpieczeństwa żywności z powodu braku ich wykrywalności konwencjonalnymi metodami badań. Do tej pory niestety niewiele wiadomo na temat genetycznych podstaw przechodzenia mikroorganizmów w stan VBNC. Ponieważ istnieje szeroki wachlarz gatunków bakterii, które mogą przechodzić w stan VBNC, prawdopodobne jest, że istnieje również zróżnicowanie w mechanizmie regulacyjnym. Poznanie mechanizmów molekularnych powstawania i resuscytacji VBNC oraz charakterystyka specyficznych markerów z pewnością będą siłą napędową rozwoju technik diagnostycznych.


Literatura:
  1. Li L, Mendis N, Trigui H, Oliver JD and Faucher SP. 2014. The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. Front. Microbiol. 5:258.
  2. Fakruddin Md., Mannan K.S.B., Andrews S. 2013. Viable but Nonculturable Bacteria: Food Safety and Public Health Perspective. ISRN Microbiology.
  3. Fleet G.H. 1999. Microorganisms in food ecosystems. Int. J. Food Microbiol., 50, 101-117.
  4. Cho J-Ch., Kim S-J. 1999. Green fluorescent protein-based direct viable count to verify a viable but non-culturable state of Salmonella typhi in environmental samples. J. Microbiol. Methods., 36, 227-235.
  5. Adamiak J., Otlewska A., Gutarowska B. 2015. Współczesne metody stosowane w analizie biodeterioracji obiektów zabytkowych. Kosmos Problemy Nauk Biologicznych, Tom 64, Nr 1, 57-69.
  6. Ramamurthy T., Ghosh A., Pazhani G.P., Shinoda S. 2014. Current Perspectives on Viable but Non-Culturable (VBNC) Pathogenic Bacteria. Front Public Health 2: 103.
  7. Olszewska M., Łaniewska-Trokenheim Ł. 2013. Odpowiedź bakterii fermentacji mlekowej na stres - stadium VBNC. ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość 5 (90), 15 – 28.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

80 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u