Komercyjne technologie masowego powielania materiału roślinnego oparte są głównie na metodzie mikrorozmnażania. Mikrorozmnażanie (rozmnażanie klonalne) to wegetatywne rozmnażanie roślin w warunkach laboratoryjnych na sztucznych podłożach (w tzw. kulturach in vitro). Termin ten oznacza wykorzystanie hodowli in vitro do rozmnażania wegetatywnego roślin. Cząstka wyrazu „mikro-” w nazwie tej techniki odnosi się jedynie do ilości wyjściowego materiału, natomiast liczba uzyskiwanych w ten sposób roślin potomnych może być bardzo duża. Poza wysokim współczynnikiem rozmnażania (proporcją liczby roślin uzyskanych do wyjściowej liczby roślin użytych do rozmnażania) ogromną zaletą tej techniki jest duże wyrównanie fenotypowe i genotypowe produkowanych roślin (np. Anthurium andreanum, Anthurium scherzerianum, Gerbera jamesonii).
Hodowlę prowadzi się w ściśle kontrolowanych warunkach dzięki czemu materiał roślinny, odizolowany od środowiska zewnętrznego, jest wolny od patogenów i szkodników niezależnie od warunków geograficznych np. rozmnażając in vitro Chrysanthemum sp. uzyskuje się rośliny wolne od wirusa karłowatości złocienia, aspermii złocienia, wirusa B złocienia.
Mikrorozmnażania jest doskonałym rozwiązaniem w przypadku produkcji roślin, które trudno rozmnażają się wegetatywnie metodami tradycyjnymi. Ponadto dzięki tej metodzie możliwa jest produkcja roślin, których nasiona są bardzo drogie, wolno kiełkujące lub mające szczególnie niską siłę kiełkowania. Cykl hodowlany przy otrzymywaniu nowych odmian roślin może zostać skrócony o 3-4 lata, jak to było w przypadku Freesia, Gladiolus czy Fragaria x ananassa.
Rozmnażanie klonalne znalazło również zastosowanie przy zachowaniu linii męskosterylnych i utrzymywaniu wsobnych linii pochodnych mieszańców F1 u takich roślin jak: Brassica campestris, Alium cepa, Asparagus officinalis. Materiał roślinny otrzymany w wyniku wegetatywnego rozmnażania można łatwo przechowywać w obniżonej temperaturze (nawet przez 2-5 lat), a także transportować jego duże ilości, co usprawnia międzynarodową wymianę materiału roślinnego (w paczce ważącej 15kg można umieścić około 40000 roślinek).
Za pomocą mikrorozmnażania na świecie produkuje się rocznie ponad 800mln sztuk roślin, z czego 90% to rośliny ozdobne.
Wielkość rocznej produkcji roślin in vitro w różnych regionach świata:
Europa – 200 mln sztuk
Afryka – 46 mln sztuk
USA i Kanada – 110 mln sztuk
Ameryka środkowa – 155 mln sztuk
Australia i Nowa Zelandia – 85 mln sztuk
Izrael i Środkowy Wschód – 92 mln sztuk
W Polsce obecnie działa około 20 laboratoriów zajmujących się mikrorozmnażaniem, głównie roślin ozdobnych tj. gerbera, fikus, różanecznik, azalia, storczyk, fikus, zatrwian, lilia, chryzantema, gloksynia, goździk, paproć, alokazja, kalmia, primula, a także borówki wysokiej, truskawki, żurawiny i jeżyny. Krajowa produkcja sadzonek in vitro jest jedną z największych w Europie i szacunkowo wynosi 70 – 100 mln sztuk na rok. Eksportowane są do: Holandii, Anglii, Hiszpanii, Izraela, Węgier, Czech, Białorusi, Bułgarii, Turcji, USA oraz na Ukrainę, Litwę i Łotwę. We Włoszech produkuje się głownie rośliny sadownicze np.: winorośl, brzoskwinie, a także podkładki dla aktinidii, moreli, jabłonie, orzecha włoskiego, gruszy, śliw. Natomiast Belgia specjalizuję się w produkcji roślin drzewiastych (Rododendron).
Etapy mikrorozmnażania
Etap I – Założenie kultury
Aby założyć kulturę należy wziąć pod uwagę kilka istotnych czynników, które determinują osiągnięcie jak najlepszej wydajności. Wybierając eksplantat pierwotny warto zwrócić uwagę na wiek rośliny (młode, zdrowe, intensywnie rosnące rośliny są lepsze); wybór organu roślinnego do pobrania eksplantatu (najłatwiej dalszy wzrost podejmują części roślin zawierające różnego rodzaju tkanki merystematyczne); porę roku (okres wiosenny – najwyższa wydajność); warunki wzrostu rośliny donorowej (optymalne warunki rozwoju, odpowiednie oświetlenie, temperatura, nawożenie); stan fitosanitarny roślin. Eksplantaty poddaje się sterylizacji, najczęściej wykorzystując do tego celu roztwory podchlorynu sodu, potasu lub wapnia, chloraminę T, chlorek rtęci, etanol, wodę utlenioną. Ważne jest żeby czas sterylizacji nie był zbyt długi oraz stężenie substancji odkażającej zbyt wysokie, ponieważ może to wywołać zamieranie tkanek. Po sterylizacji należy trzykrotnie wypłukać eksplantat w sterylnej wodzie. Następnie materiał roślinny przenosi się na pożywki. W ciągu 3-6 tygodni po wyłożeniu na pożywkę następuje tzw. stabilizacja hodowli, w efekcie której uzyskuje się aseptyczny i zdolny do namnażania eksplantat. Na tym etapie selekcjonuje się materiał roślinny i odrzuca nieprawidłowo rozwinięty, nekrotyczny, zdeformowany i porażony.
Etap II – Masowe namnażanie
Etap ten polega na powielaniu materiału roślinnego, dzielenie go i przenoszenia na świeże pożywki. Trwa to aż do uzyskania pożądanej ilości egzemplarzy. W tym okresie aseptyczny materiał roślinny (np.: zarodki somatyczne, pąki przybyszowe, pędy, wieloroślinki) zabezpiecza się przed drobnoustrojami poprzez stałą kontrolę powietrza w pomieszczeniach hodowlanych i testowanie sterylności komór laminarnych. Długość pojedynczego pasażu wynosi od 3 do 8 tygodni i zależy od: gatunku rośliny, chemicznych warunków rozmnażania, fizycznych warunków rozmnażania. Nie powinno się dopuścić starzenia się kultur ponieważ może to doprowadzić do obniżenia żywotności i zdolności do ukorzeniania w następnych pasażach.
Etap III – Adaptacja uzyskanych roślin do normalnych warunków
Przed przeniesiem do warunków in vivo materiał roślinny hartuję się przez zmniejszenie poziomu cukrów w pożywce oraz obniżenie temperatury i zwiększenie natężenia światła w pomieszczeniach hodowlanych (fitotronach). Właśnie wtedy uzyskane pędy zmuszane są do wytworzenia systemu korzeniowego, warstwy ochronnej tkanek oraz uruchomienia efektywnych procesów transpiracji i fotosyntezy.
Ukorzenianie przeprowadza się w zależności od gatunku rośliny:
– w warunkach in vitro – długość okresu ukorzeniania pędów na pożywkach o zredukowanej zawartości minerałów wynosi od 1-6 tygodni,
– w warunkach ex vitro – ukorzenianie pędów prowadzone w tych warunkach przebiega równocześnie z aklimatyzacją i wytwarzaniem nowych liści.
Następnie rośliny wysadza się do doniczek, wypełnionych substratem (np. mieszaniną ziemi, torfu i perlitu) i umieszcza w optymalnych warunkach. Z chwilą przyjęcia się rośliny proces mikrorozmnażania zostaje zakończony.
Sposoby mikrorozmnażania
– pobudzanie do rozwoju pąków bocznych
– formowanie pąków przybyszowych bezpośrednio lub pośrednio przez kalus
– embriogenezę somatyczną
Najlepiej poznaną metodą jest ta pierwsza, choć wydajność reprodukcyjna tej metody jest ograniczona liczbą pąków na eksplantatach (2-20 pąków). Dwa pozostałe charakteryzują się bardzo dobrą wydajnością rozmnażania, lecz szczegółowe protokoły są opracowane dla niewielu odmian.
Kultury pąków bocznych
Najczęściej używanymi eksplantatami do inicjacji kultur in vitro pędów bocznych są: merystemy wierzchołkowe, merystemy pąków bocznych wierzchołki pędów, pąki kwiatowe (boczne), fragmenty pędów z węzłem, parą liści i pąkiem bocznym. Eksplantaty wykłada się na pożywki z dodatkiem cytokininy, umożliwiając rozwój już istniejących i tworzenie się nowych pąków kątowych. Klony roślin uzyskane tą metodą są wyrównane fenotypowo i wykazują genetyczną stabilność. Bardzo istotnym aspektem wykorzystania tej metody jest poprawienie zdrowotności roślin. Kultury merystemów pozwalają otrzymać materiał roślinny wolny od patogenów, a zwłaszcza od wirusów. Wykazano, że merystem wierzchołkowy pędu nie zawiera wirusów, bądź posiada ich niewiele i że traci je w trakcie kultury. Często, w celu wydajniejszego procesu odwirusowania technikę mikrorozmnażania łączy się z termoterapią – traktowaniem materiału roślinnego podwyższona temperaturą in vivo (przed pobraniem eksplantatu, 26-45°C przez 4 do 12 tygodni) lub in vitro (30-36°C, przez 4 do 8 tygodni) lub z chemioterapią – dodaniem do pożywek antymetabolitów, sufraktantów czy rybawiryny (związków o wysokiej aktywności przeciwwirusowej).
Kultury te znalazły zastosowanie u:
– roślin ozdobnych (Orchidiaceae, Chrysanthemum, Gloxinia, Spatiphyllum, Nephrolepsis, Gerbera, Dianthus, Funkia, Freesia, Nicotiana)
– drzew owocowych i podkładek drzew owocowych (Corylus avellana, Malus domestica, Pyrus communis, Prunus domestica, Armeniaca vulgaris)
– jagodowych (Fragaria x ananasa)
– tropikalnych i subtropikalnych (Malus paradisiaca, Ananas comosus, Morus sp., Hevea brasiliensis)
Kultury pąków przybyszowych
Części rośliny, na których mogą powstawać pąki przybyszowe to korzenie łodygi, liście, kwiatostany, łuski cebulowe czy pędy kwiatowe. Metoda wykorzystywana przede wszystkim u roślin, które z trudem wytwarzają pąki boczne. Na powstawanie i intensywny rozwój pąków przybyszowych w warunkach in vitro wyraźny wpływ mają: rodzaj i wzajemne proporcje zastosowanych auksyn i cytokin, warunki fizyczne hodowli (zwłaszcza światło i temperatura), rodzaj tkanki, gatunek rośliny, kondycja kultury.
Różnicowanie się pąków przybyszowych następuje za pośrednictwem tkanki kalusowej (organogeneza pędowa pośrednia) lub bezpośrednio na eksplantacie (kaulogeneza). Organogeneza pędowa pozwala na uzyskanie wyższego współczynnika rozmnażania w porównaniu do hodowli wierzchołków pędów czy pąków kątowych. Inna formą organogenezy jest ryzogeneza (tworzenie korzeni przybyszowych). Jednak bardzo rzadko udaje się odtworzyć roślinę z korzenia, dlatego nie jest ona wykorzystywana w mikrorozmnażaniu.
Kultury pąków przybyszowych znalazły zastosowanie u:
– roślin ozdobnych (Orchidaceae, Gesneriaceae, Piperaceae)
– w tym roślin cebulowych (Amaryllidaceae, Iridaceae, Liliaceae)
– zbóż (Oryza sativa, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Zea mays)
Embriogeneza somatyczna
<img src=”http://e-biotechnologia.pl/obrazki/mikrorozmnazanie-roslin.jpg” ALIGN=”left” alt=”mikrorozmnażanie-roślin” HSPACE=10 VSPACE=10 />To proces biologiczny, podczas którego w warunkach in vitro z komórek wegetatywnych formują się zarodki. Jest on łatwy w automatyzacji, tani i niepracochłonny. Zarodki somatyczne to proste struktury z wyodrębnioną osią pęd – korzeń, morfologicznie podobne do zarodków zygotycznych wytworzonych w procesie zapłodnienia. Również ich rozwój jest podobny: pojedyncza komórka, drobne agregaty komórkowe, zarodek kulisty (globularny), sercowaty, torpedowaty i stadium liścieniowe. W wyniku formowania zarodków somatycznych można w warunkach in vitro uzyskać wysoki współczynnik namnażania materiału roślinnego. Materiałem wyjściowym do produkcji takich zarodków mogą być np. fragmenty młodych liści, hipokotyle i liścienie siewek, czy nawet igły roślin. Opisane wcześniej metody rozmnażania polegają na namnażaniu pąków i pędów, czyli struktur jednobiegunowych, a odtwarzanie korzeni zachodzi w kolejnym etapie w laboratorium lub w warunkach in vivo. Efektem końcowym embriogenezy somatycznej jest kompletna roślina z jednym lub dwoma liścieniami, epikotylem i korzonkiem zarodkowym. Zarodki somatyczne można z powodzeniem wykorzystać przy produkcji sztucznych nasion.
Metoda znalazła zastosowanie tam, gdzie uzyskanie nasion może być trudne i długotrwałe. Dzięki niej można otrzymać dowolną ilości zdrowego, wyrównanego materiału siewnego, niezależnie od warunków pogodowych w zaplanowanym terminie. Ponadto istnieją doniesienia, że naukowcy z Kanadyjskiego Centrum Włókien Drzewnych chcą wykorzystać embriogenezę somatyczną do masowej produkcji takiej krzyżówki sosny białej, która będzie odporna na rdzę wejmutkowo-porzeczkową. Jest to choroba drzew iglastych, przede wszystkim sosen i porzeczek, głównie porzeczki czarnej, wywołana przez patogenny grzyb Cronartium ribicola. Naukowcy planują również współpracę z partnerami przemysłu leśnego w celu wykorzystania tego procesu do produkcji sadzonek świerka białego o wydajniejszym wzroście i lepszych cechach jakościowych (świerk biały jest coraz chętniej wybieranym gatunkiem drzewa, ponieważ charakteryzuje się podczas całego cyklu hodowlanego wyższą produkcją drewna niż świerk czarny).
Embriogenezę somatyczną się do:
– komercyjnego rozmnażania drzew leśnych (Pseudotsuga menziesii, Pinus taeda, Picea bies)
– namnażania niektórych gatunków należących do rodzin (Umbelliferae, Solanacae, Cruciferae, Primulaceae)
Przykłady roślin u których wykorzystuje się rozmnażane klonalne
Niektóre gatunki roślin sadowniczych rozmnażane in vitro:
Agrest, borówka brusznica, kiwi, ananas jadalny, banan, borówka amerykańska, brzoskwinia, cytryna, czereśnia ptasia, daktylowiec właściwy, grusza pospolita, malina właściwa, jabłoń dzika, mandarynka, kasztan jadalny, marakuja, leszczyna pospolita, migdałowiec zwyczajny, limonka, mirabelka, truskawka, papaja, pomarańcza, porzeczki.
Rośliny ozdobne:
Agawa, bluszcz pospolity, cebulica syberyjska, begonia stale kwitnąca, azalia japońska, cyklamen perski, frezja, dracena, goździk ogrodowy, gerbera Jamesona, hoja różowa, lilia biała, grubosz, liliowiec, lak pospolity, róże, sagowce, pelargonie.
Drzewa i krzewy:
Akacja, araukaria, brzoza zwisła, dąb czerwony, hortensja ogrodowa, jodła balsamiczna, morwa biała, ostrokrzew, sekwoja olbrzymia, sosna czarna, świerk biały, topola czarna,.
Rośliny użytkowe:
Bawełna afrykańska, burak zwyczajny, chmiel zwyczajny, herbata chińska, jęczmień zwyczajny, kawa arabska, koniczyna biała, kauczukowiec brazylijski, kakaowiec właściwy, len zwyczajny, maniok jadalny, oliwka europejska, proso zwyczajne, orzech ziemny, pszenica, słonecznik, ziemniak, żyto, sorgo, pszenica.
Warzywa:
Brukselka, cebula, chrzan, cykoria, fenkuł, czosnek, dynia, groszek, kalafior, kapusta, kawon, karczoch, koper, marchew, papryka, pomidor, por, seler, szparag lekarski.
Rośliny lecznicze:
Naparstnica purpurowa, bieluń dziędzierzawa, mak lekarski, nagietek lekarski, mniszek lekarski, żeńszeń właściwy.
Autor: Joanna Chojak
Literatura:
1. Biotechnologia roślin. S. Malepszy, PWN 2004.
2. http://www.wbp.olsztyn.pl/
3. http://www.horticentre.pl/index.php/course
Zdjęcia:
http://www.mnr.gov.on.ca/en/Business/OFRI/2ColumnSubPage/271920.html
http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/library/snapdragon/micropropagation.html
