biotechnologia


 
 

Nowoczesne technologie laboratoryjne w bankowaniu zamrożonych próbek w ciekłym azocie

Autor artykułu:
Paula Ślipek
Air Liquide Polska Sp. zo.o.
Ul. J. Conrada 63,
31-357 Kraków
tel : (32) 790 81 19
www.kriobiologia.eu
paula.slipek@airliquide.com

Ciekły azot (LIN) N2 w 78% jest składnikiem ziemskiej atmosfery. Do celów handlowych produkowany jest w kriogenicznych Jednostkach Rozdziału, gdzie powietrze atmosferyczne jest czyszczone, sprężane i schładzane by go skroplić i z którego poszczególne gazy są odseparowywane podczas destylacji frakcyjnej w temperaturach kriogenicznych. Ciekły azot jest przechowywany i transportowany w specjalnie izolowanych próżniowo zbiornikach i cysternach w temperaturach z przedziału od -196°C do -155°C i odpowiadających ciśnieniom od atmosferycznego do ok. 20 barów. Jako gaz skroplony, azot jest używany głównie jako czynnik kriogeniczny do schładzania i mrożenia produktów. Jakość w jednostkach produkcyjnych zapewniona jest dzięki ciągłym analizom procesu i gdzie każdorazowo przeprowadza się analizy każdego zbiornika przed i po jego napełnieniu.




kriobiologia
Wstęp

Kriobiologia jako dyscyplina badawcza mieści się na rozdrożu fizyki i biologii. To precyzyjna nauka, która determinuje warunki, w jakich zachodzi krioprezerwacja życia i funkcji biologicznych w ekstremalnie niskich temperaturach rzędu minus 196°C. Tematyka kriobiologii laboratoryjnej opiera się na zamrażaniu w ciekłym azocie preparatów biologicznych (w tym tkanek, komórek i nasion) w fiolkach, słomkach, czy torebkach umieszczanych w różnorakich systemach butlowych i przystosowanych do tego zamrażarkach kriogenicznych, wspomaganych nowoczesnymi rozwiązaniami technicznymi i specjalistycznymi technologiami informatycznymi, które usprawniają system mrożenia podnosząc jakość i bezpieczeństwo zamrożonego materiału biologicznego. Krioprezerwacja stosowana jest w instytutach badawczych, laboratoriach In-vitro, bankach krwiodawstwa, bankach nasienia, komórek jajowych, czy komórek macierzystych, bankach nasion roślinnych, szpitalach, lecznicach weterynaryjnych, a nawet ogrodach botanicznych i arboretach.




kriobiologia
Czy wiesz, że…?

Po raz pierwszy azot i tlen skroplili polscy fizycy, Karol Olszewski i Zygmunt Wróblewski? Miało to miejsce w 1883 roku.


Technologia mrożenia w azocie

Krioprezerwacja to nic innego jak proces zamrażania i przechowywania tkanek lub komórek w ekstremalnie niskiej temperaturze około 77K, tj. -196°C. Mimo temperatur, kojarzonych raczej z destrukcją, a nie dobroczynnym na organizmy działaniem, zamrażanie komórek i tkanek w odpowiednim tempie pozwala zachować ich naturalne właściwości oraz aktywność biologiczną. Oczywiście nie bez znaczenia jest stosowanie mieszanin witryfikujących, które mają za zadanie chronić komórki przed uszkodzeniami mogącymi wynikać z ich odwodnienia, uszkodzenia w wyniku ponownego ogrzania, czy tworzenia się między nimi lub w ich wnętrzu kryształków lodu. Właśnie dlatego stosowane są różnorakie krioprotektanty, które w odpowiednim stężeniu nie są dla nich szkodliwe, a dzięki którym proces chłodzenia jest znacznie szybszy. Badania dowodzą, że wpływ zamrażania i przechowywania próbek biologicznych w azocie nie wpływa negatywnie na ich jakość. Wręcz przeciwnie. Okazuje się, że zamrożone wcześniej embriony wykazują lepszą jakość w stosunku do świeżych, na co wskazuje zmniejszenie liczby poronień, przedterminowych porodów, czy wad genetycznych u dzieci, choć szczegółowe przyczyny tego zjawiska nie są do końca znane. Kontrolowane zamrażanie tkanek i komórek znane jest już od lat 70-tych, co ówcześnie pozwoliło na narodziny pierwszego człowieka z zamrożonego wcześniej embrionu. Był to niewątpliwy przełom w biotechnologii.

kriobiologia

Od tamtej pory technika krioprezerwacji poszła znacznie do przodu, dzięki czemu na całym Świecie mają zastosowanie nowoczesne urządzenia, które mrożą próbki biologiczne w ciekłym azocie przy użyciu programowalnych procesów. Dzięki temu możliwa jest nie tylko krioprezerwacja tkanek, czy komórek, ale i właśnie embrionów, komórek macierzystych, skóry, krwi, oocytów, nasienia tak ludzkiego, jak i zwierzęcego, a nawet nasion roślin. Wszystko to, dzięki odpowiednio dostosowanym technologiom, pozwala na rozwijanie krioprezerwacji i badań naukowych w tym kierunku. Firma Air Liquide od wielu lat oferuje linię produktów dedykowanych dla zastosowań laboratoryjnych i analitycznych. Odpowiednio przystosowane ku temu zbiorniki kriogeniczne wykorzystywane są do transportu i magazynowania ciekłego azotu oraz przechowywania próbek biologicznych i transportowania materiału genetycznego w różnorakich słomkach, fiolkach oraz workach.




Czy wiesz, że…?

W 1898 roku niejaki James Dewar po raz pierwszy wykorzystał naczynie o podwójnych ściankach, spomiędzy których usunięto powietrze. Naukowiec przechowywał w nim początkowo sprężony i oziębiony wodór. Dziś zbiorniki kriogeniczne, służące do przechowywania ciekłych gazów, nazywane są właśnie dewarami od nazwiska ich pioniera. To właśnie ten wynalazek, wykorzystujący technikę próżniową izolacji, pozwolił na gromadzenie ciekłych gazów w ekstremalnie niskich temperaturach, nie dopuszczając do ich zbytniego odparowywania, wynikającego z właściwości fizykochemicznych.




Nowoczesne zbiorniki do przechowywania i transportu próbek biologicznych w ciekłym azocie

Współczesne technologie pozwalają na przechowywania zarówno małych, jak i bardzo dużych ilości ciekłego azotu, a nowoczesne techniki próżniowe znacząco wydłużają statyczny czas utrzymywania się substancji w zbiornikach, dzięki czemu redukuje to straty wynikające z naturalnych właściwości fizykochemicznych azotu, powodowanych odparowywaniem gazu z powodu kontaktu z cieplejszym otoczeniem.
kriobiologia
Fot.1. Zbiorniki CryoPal Air Liquide typu AGIL


Firma CryoPal wchodząca w skład Grupy Air Liquide to jedyna taka na rynku, która oferuje pełną różnorodność w zakresie produkcji i dystrybucji urządzeń niezbędnych do badań nad krioprezerwacją, wychodząc tym samym naprzeciw oczekiwaniom laboratoriów. Charakterystykę urządzeń do przechowywania azotu i próbek biologicznych rozpoczniemy od zbiorników kriogenicznych o najmniejszej pojemności, jakimi są Zbiorniki typu AGIL. To zbiorniki wykonane ze stali nierdzewnej przeznaczone do pracy z małymi ilościami ciekłego azotu. W ofercie znajdują się zbiorniki o pojemności od 0,5 l do 6l. Lekkie, mocne i kompaktowe są praktyczne w użyciu, dzięki górnym i bocznym uchwytom. Zakres temperatury pracy wynosi od -200 °C do +200 °C. Stosowane najczęściej w laboratoriach medycznych, farmaceutycznych i badawczych. Statyczny czas utrzymania ciekłego azotu w temperaturze 20°C bez pokrywy wynosi od 12 do 49 dni. Zbiorniki typu AGIL umożliwiają pracę zarówno z gorącymi, jak i zimnymi cieczami. Najczęściej służą transportowaniu próbek biologicznych w ciekłym azocie w laboratoriach oraz manualnym obniżaniu temperatury materiału biologicznego. Nierzadko stosuje się je do krótkotrwałego przechowywania niewielkich ilości ciekłego azotu do codziennej pracy w laboratoriach.



kriobiologia
Fot. 2. Zbiorniki CryoPal Air Liquide typu TR

Inne i jednocześnie najpopularniejsze urządzenia kriogeniczne to linia zbiorników bezciśnieniowych typu TR, działająca na zasadach systemu próżniowego, która przeznaczona jest do magazynowania i transportu ciekłego azotu. Dodatkowe elementy wyposażenia zbiorników TR (tj. podstawa na kółkach, uchwyty, stojaki przechyłowe, system DL3 do ciśnieniowej dekantacji, system dozowania ciekłego azotu, węże przesyłowe, lance przesyłowe) ułatwiają pracę i umożliwiają zwiększenie jej efektywności. Pojemność zbiorników TR wynosi od 11 do 100 litrów. Statyczny czas utrzymania azotu to maksymalnie 180 dni dla największych diuarów.



kriobiologia
Fot. 3. Zbiorniki CryoPal Air Liquide typu TP

Kolejne bardzo popularne w laboratoriach, przemyśle i biotechnologii urządzenia do przechowywania ciekłego azotu to również niskociśnieniowe (zaledwie 0,5 barowe) zbiorniki typu TP. Pojemność tych urządzeń wynosi od 35 do 100 litrów. Wskaźnik pływakowy pozwala na bieżącą kontrolę poziomu ciekłego azotu. Głowica zbiornika jest wyposażona w manometr wskazujący ciśnienie w zbiorniku oraz dwa zawory bezpieczeństwa, a jej demontaż zajmuje kilka sekund. Zbiorniki są dostarczane z głowicą roboczą lub bez niej, w zależności od potrzeb. Statyczny czas utrzymywania azotu w zbiorniku TP to maksymalnie 75 dni. Zbiorniki cechuje aż sześcioletnia gwarancja próżni. Poprzez wąż przelewowy można dokonywać zasilania ciekłego azotu do zbiorników typu VOYAGEUR, czy TR, służących do transportu cieczy.



Firma Air Liquide produkuje jednak nie tylko zbiorniki służące wyłącznie przechowywaniu i transportowaniu ciekłego azotu, ale również specjalnie zabezpieczonych próbek biologicznych w odpowiednio do tego przystosowanych fiolkach, słomkach, czy workach.

kriobiologia
Fot. 4. Zastosowanie laboratoryjne zbiornika ARPEGE

Najpopularniejsze z nich to zbiorniki typu GT, zbiorniki typu ARPEGE, oraz zdecydowanie większe i mniej przystosowane do transportu z uwagi na wielkość zbiorniki typu ESPACE oraz RCB. Do transportu niewielkiej ilości próbek biologicznych w azocie zastosowanie znajdują dodatkowo specjalistyczne zbiorniki typu VOYAGEUR.

Linia zbiorników ARPEGE została zaprojektowana do długoterminowego przechowywania próbek biologicznych w słomkach, fiolkach lub torbach. Opcjonalna możliwość kontroli poziomu ciekłego azotu i wskazań temperatury, automatycznego systemu napełniania, skomputeryzowanego zarządzania przechowywanymi próbkami w zbiornikach ARPEGE zapewnia optymalne warunki przechowywania próbek. Zbiorniki te o pojemności od 40 do 170 litrów mają szerokie zastosowanie w laboratoriach badawczych, centrach inseminacyjnych, bankach nasienia i IVF oraz laboratoriach medycznych. Zbiorniki ARPEGE cechuje szeroki wybór wyposażenia dla każdego typu fiolek (2ml lub 5ml). System zabezpieczający ochrania przed opadnięciem próbek, co jest wyłącznym patentem Air Liquide. Dodatkowo innowacyjny asortyment do magazynowania słomek pozwala na stały dostęp do nich oraz zapewnia bezpieczne ich magazynowanie. Opcjonalnie dostępny jest kompletny elektroniczny system kontroli stanu magazynowanych próbek za pomocą oprogramowania Coolbase. Zbiorniki ARPEGE są zgodne z dyrektywą dla wyrobów medycznych (93/42/EEC).



kriobiologia
Fot. 6.
Zastosowanie laboratoryjne zbiornika GT

Zbiorniki GT o wydłużonym czasie przechowywania to również linia zaprojektowana do długoterminowego przechowywania próbek biologicznych w słomkach lub fiolkach. Odparowywanie azotu w zbiornikach GT jest bardzo niskie, co pozwala na wyjątkowo długi czas przechowywania. GT to najlepsze dopasowanie do potrzeb laboratoriów – możliwe jest zastosowanie dwóch typów kanistrów: metalowych lub plastikowych, jedno lub dwupoziomowych (GT11/21/35). Aluminiowa pokrywa z zastosowaniem super-izolacji i żywicznego kołnierza zapewniają wysoką efektywność termiczną, lekkość i wytrzymałość. Poliuretanowa powłoka lakiernicza zapewnia wysoką jakość i wydłuża żywotność zbiornika.

kriobiologia
Fot. 5. Kolorystyczne identyfikowanie słomek w zbiornikach GT

Zbiorniki GT wykonane są zgodnie z rygorystycznymi wymogami jakościowymi (ISO 9001:2000). Wszystkie zgodne są z międzynarodowymi przepisami mającymi zastosowanie do transportu materiałów niebezpiecznych drogą lądową (ADR), lotniczą (IATA-OALI) i kolejową (RID), a także dyrektywą dla wyrobów medycznych (93/42 EEC). Maksymalna pojemność zbiorników GT to 1200 fiolek lub 16400 słomek, które są kolorystycznie posortowane i opisane dla lepszego ich rozpoznawania w przypadku długiego czasu przechowywania. Największy ze zbiorników typu GT doposażony w system NATAL 40 posiada wskaźnik temperatury wewnątrz zbiornika oraz system RS485 do wykrywania zapisanych danych. Ponadto każdy ze zbiorników może być doposażony w zamek zabezpieczający przed jego otwarciem przez niepowołane osoby.

Kolejnymi zbiornikami do długoterminowego magazynowania próbek w azocie są duże gabarytowo zbiorniki typu ESPACE, w których przechowywanie materiału każdego rodzaju może odbywać się przy pomocy fiolek o pojemności 2ml i 5ml, słomek w kanistrach lub statywie lub torebek z kasetą bądź bez.

kriobiologia
Fot. 7. Zastosowanie laboratoryjne zbiornika ESPACE

Zbiorniki są wydajne i łatwe w użyciu, ale przede wszystkim technologia ESPACE jest gwarancja niezawodności. Jakość komory kriogenicznej, jak również systemy monitorowania i kontroli zbiornika, zapewniają bezpieczne przechowywanie najbardziej wartościowych produktów. Popularność zbiorników odnotowuje się głównie w laboratoriach badawczych, centrach inseminacyjnych, bankach nasienia, IVF oraz laboratoriach medycznych. W zbiorniku ESPACE przechowywanie próbek może odbywać się zarówno w ciekłej fazie azotu, jak i gazowej. Łatwość obsługi zbiornika ESPACE wynika dodatkowo z jego szerokiego otworu wsadowego oraz obrotowej tacy (z wyjątkiem ESPACE 151), co umożliwia bezproblemowy dostęp do magazynowanych próbek. System monitoringu wyraźnie pokazuje poziom cieczy i temperaturę przechowywania. Interfejs zdalnego sterowania używany jest do monitorowania i kontroli pojemnika. Duża różnorodność akcesoriów umożliwia spełnienie najbardziej specyficznych potrzeb. Zbiorniki mają sześć lat gwarancji próżni i są zgodne z dyrektywą dla wyrobów medycznych (93/42 EEC).

Zbiorniki RCB to również duże gabarytowo zasobniki ze stali nierdzewnej o pojemności od 500 do 1000 litrów przeznaczone do długoterminowego i efektywnego przechowywania próbek w azocie. Materiał biologiczny może być przechowywany w fazie ciekłej i gazowej azotu tak w fiolkach i słomkach jak i w torbach. Wąski otwór wsadowy zmniejsza parowanie azotu do minimum i umożliwia przechowywanie w bardzo niskich temperaturach. Do przechowywania w fazie gazowej zaprojektowano zbiorniki RCB 600 i 1001, w których nie ma kontaktu pomiędzy ciekłym azotem a próbkami, bez zmniejszania ich ładowności. Koszty eksploatacji są wyjątkowo niskie ze względu na bardzo niskie zużycie azotu. Precyzyjne wykonanie ze stali nierdzewnej zapewnia wyjątkowo długą żywotność zbiorników. Otwierana pokrywa umożliwia łatwą obsługę.

kriobiologia
Fot. 8. Zbiorniki Air Liquide typu RCB
Zbiorniki RCB są być wyposażone w każdy z systemów zdalnego monitorowania i kontroli Air Liquide. Zbiorniki są oczywiście zgodne z dyrektywą dla wyrobów medycznych (93/42 EEC) i mają sześcioletnią gwarancję próżni.

W celu bezpiecznego transportu próbek w ciekłym azocie została zaprojektowana specjalna linia zbiorników VOYAGEUR. Wnętrze wykonane z porowatego materiału absorbuje ciekły azot, dzięki czemu próbki utrzymywane są w bezpiecznej dla nich fazie gazowej. Transport próbek jest całkowicie bezpieczny dzięki całkowitemu wyeliminowaniu ryzyka wycieku azotu. Bardzo niskie zużycie azotu zapewnia dłuższy czas przechowywania od 8 aż do 28 dni. Standardowe pojemności zbiorników typu VOYAGEUR to od 2 do 20 litrów. Zbiornik wyposażony jest w stojaki do fiolek, słomek lub toreb - odpowiednio do potrzeb. Zbiorniki są zgodne z międzynarodowymi przepisami mających zastosowanie do transportu materiałów niebezpiecznych drogą lądową (ADR), lotniczą (IATA-OACI) i kolejową (RID). Dodatkowym atutem tych zbiorników są liczne akcesoria takie jak podstawa na kółkach, plastikowa osłona na zbiornik, czujnik umożliwiający śledzenie wahań temperatury, pokrywa, kanistry, czy kieszenie na próbki i torby.

Oprócz zbiorników do przechowywania czy to ciekłego azotu, czy materiału biologicznego w azocie firma CryoPal Grupy Air Liquide oferuje również kriogeniczne zamrażarki NICOOL FREEZAR, służące również do magazynowania próbek.

kriobiologia
Fot. 9. Linia zbiorników do transportu próbek w azocie typu VOYAGEUR

Zamrażarka NICOOL FREEZAL z intuicyjnymi funkcjami programowania, przeznaczona jest do zamrażania wszystkich rodzajów próbek biologicznych. Dzięki technologii Plug N'FREEZE możliwe jest łatwe tworzenie, zapisywanie i drukowanie protokołów przy pomocy oprogramowania MS Windows XP dostępnego w różnych językach (język polski - na specjalne zamówienie). Została zaprojektowane z myślą o zaspokojeniu potrzeb bezpieczeństwa (programowanie warunków przechowywania najbardziej wartościowych produktów), jak i elastyczności (programowanie optymalnych protokołów dla każdego rodzaju próbki). Zamrażarka NICOOL jest podłączana do komputera stacjonarnego oraz zbiornika ciśnieniowego (TP), z którego pobierany jest azot.



kriobiologia
Fot. 10. Zamrażarki kriogeniczne Air Liquide

Operator konfiguruje żądany cykl zamrażania, a oprogramowanie kontroluje zaprogramowany cykl w zakresie temperatur od +37°C do -170°C. Temperatura produktów jest mierzona przez czujnik umieszczony na próbce odniesienia, natomiast wtrysk azotu, wentylacja i ogrzewanie komory są kontrolowane na podstawie ich reakcji termicznych. Zaszczepianie (odprowadzenie ciepła utajonego) może odbywać się ręcznie lub automatycznie. Co ważne, temperatura komory i próbki odniesienia są monitorowane w czasie rzeczywistym, a najmniejsza rozbieżność w odniesieniu do wymaganego protokołu jest natychmiast wykrywana. Zamrażanie jest sterowane na podstawie temperatury próbki odniesienia, co umożliwia lepszą kontrolę reakcji cieplnej próbek. Każdy protokół może być przechowywany w celu powtarzalności zamrażania. Istnieją również specjalistyczne zamrażarki kriogeniczne przeznaczone do mrożenia embrionów, w których słomki są umieszczane poziomo w komorze nad ciekłym azotem. Cykl zamrażania jest definiowany przez 3 parametry, które wprowadza się na programatorze, a są to: temperatura stabilizacji przed zaszczepianiem (odprowadzenie ciepła utajonego), temperatura pośrednia przed zanurzeniem w ciekłym azocie oraz prędkość schładzania w °C/minutę między oboma wartościami. Zaszczepianie odbywa się ręcznie. Temperatura słomek jest następnie obniżana, zgodnie z zaprogramowaną prędkością schładzania, a cykl zamrażania kończy się przez zanurzenie komory w ciekłym azocie. Zamrażarka ma kształt walizki i jest łatwa w transporcie. Wszystkie urządzenia są zgodne z dyrektywą dla wyrobów medycznych (93/42 EEC) oraz 21CFR część 11 i są niezwykle popularne w laboratoriach medycznych, farmaceutycznych i badawczych.




kriobiologia
Podsumowanie

Jak widać różnorodność rozwiązań technicznych w zakresie mrożenia próbek biologicznych w ciekłym azocie jest bardzo ważna i zdecydowanie usprawnia pracę laboratoryjną biotechnologów, a nowoczesne rozwiązania teleinformatyczne pozwalają na dbałość o bezpieczeństwo przechowywania zamrożonego materiału. Dodatkowe kompleksowe rozwiązania Air Liquide w zakresie wyposażenia elektronicznego przeznaczone są do rejestracji kluczowych informacji związanych z wymaganiami technicznymi przechowywanych produktów w zbiornikach kriogenicznych, jak np. temperatura i poziom cieczy lub gazu, czy automatyczne napełnianie zbiorników. Popularne systemy wspomagające pracę z gazami ciekłymi to na przykład urządzenia bezpieczeństwa typu Tempal, gwarantujące niezawodność dostaw substancji kriogenicznej, jaką jest ciekły azot, poprzez stały pomiar temperatury gazu w zbiornikach i system alarmowy włączający się w przypadku problemów wewnątrzinstalacyjnych, czy też systemy Optimal zapewniające teletransmisję danych i ciągły monitoring krytycznych zmiennych procesu. Systemy monitorujące stan ciekłych gazów w zbiornikach kriogenicznych typu Kriomemo, tworzone i stale ulepszane przez firmę CryoPal, montowane są również przy mniejszych zbiornikach i pozwalają na stałe kontrolowanie ilości, temperatury i stanu gazu w zbiorniku. Wszystko to ma na celu umożliwienie rozwoju kriobiologii według szerokiego spektrum jej możliwości. Krioprezerwacja jest obecnie stosowana w wielu ośrodkach badawczo-rozwojowych, co pozwala na ogromny rozwój medycyny w tym zakresie.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

306 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy matura.biomist.pl

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u