biotechnologia


 
 

Peptydy

Termin peptyd został po raz pierwszy zaproponowany w XIX w. przez Emila Fishera, jako określenie grupy związków organicznych posiadających charakterystyczne wiązanie peptydowe. Powstają one w wyniku reakcji kondensacji aminokwasów, których rodzaj oraz liczba wpływa na właściwości budowanej cząsteczki.


Kondensacja i hydroliza

Peptydy powstają w wyniku reakcji kondensacji, podczas której między grupą α-karboksylową (-COOH) i grupą α-aminową (-NH2) tworzy się połączenie zwane wiązaniem peptydowym. Produktem ubocznym jest cząsteczka wody.

Reakcja odwrotna, czyli hydroliza, polega na rozerwaniu utworzonych wiązań peptydowych i odtworzeniu poszczególnych aminokwasów. Bierze w niej udział woda, której cząsteczki rozpadają się na grupy wodorotlenowe (-OH) i atomy wodoru (H), a następnie łączą się z uwolnionymi wiązaniami substancji wielkocząsteczkowej. Analizując skład otrzymanych produktów hydrolizy można ustalić, z jakich reszt aminokwasowych składał się dany peptyd.



Rys.1 Reakcja kondensacji i hydrolizy peptydu. Wiązanie peptydowe oznaczono kolorem czerwonym.

Struktura peptydów

Ogólne właściwości peptydów zależą od natury budujących je aminokwasów, np. rozpuszczalność zależy od ilości hydrofobowych łańcuchów bocznych, a właściwości kwasowo-zasadowe od ilości grup kwasowych i zasadowych.

Do zapisu kolejności aminokwasów używa się symboli trójliterowych połączonych kreskami reprezentującymi wiązania peptydowe lub też symboli jednoliterowych. W przypadku niepewności co do ułożenia fragmentu, jego sekwencję aminokwasową umieszcza się w nawiasie i oddziela przecinkami. Aminokwas zachowujący wolną grupę aminową umieszcza się po lewej stronie i nazywa aminokwasem N-końcowym. Analogicznie aminokwas z wolną grupą karboksylową umieszcza się po stronie prawej i określa mianem C-aminokwasu.

Liczba i sekwencja aminokwasów wyznacza strukturę pierwszorzędową peptydu i w znaczący sposób wpływa na aktywność biologiczną cząsteczki


Wiązania w peptydach

W cząsteczkach peptydów występują różne rodzaje wiązań stabilizujących ich konformację i umożliwiających łączenie się ze sobą różnych łańcuchów.

Najistotniejszą rolę odgrywają wiązania peptydowe (-CO-NH-) tworzące się pomiędzy poszczególnymi resztami aminokwasowymi. Badania krystalograficzne wykazały, że występujące w nich wiązanie C-N jest znacznie krótsze niż w przypadku innych połączeń węgla i azotu. Jest to spowodowane mezomerycznym charakterem wiązania peptydowego i brakiem swobodnego obrotu wokół wiązania C-N. Oznacza to, że istnieją jedynie dwie stabilne konformacje cis i trans, w których atomy wiązania znajdują się w jednej płaszczyźnie.



Rys.2 Formy mezomeryczne wiązania peptydowego

Innym ważnym wiązaniem występującym w cząsteczkach peptydów jest wiązanie disulfidowe tworzące się przez utlenienie grupy funkcyjnej -SH cysteiny. Wewnątrzcząsteczkowe wiązanie S-S spotyka się np. w oksytocynie lub insulinie.

W peptydach istnieje również wiele elementów mogących tworzyć wiązania wodorowe, powstające w wyniku oddziaływań między atomami O i N jednej cząsteczki, a grupami -NH i -OH drugiej cząsteczki.

Dodatkową możliwość stabilizacji konformacji peptydów stwarzają wiązania jonowe powstające w wyniku elektrostatycznych oddziaływań pomiędzy dodatnimi i ujemnymi ładunkami grup aminowych i karboksylowych.

Dla stabilizacji konformacji ważne są także oddziaływania hydrofobowe.


Klasyfikacja peptydów

Najczęściej podziału peptydów dokonuje się ze względu na ilość budujących je aminokwasów. Cząsteczki składające się z dwóch reszt aminokwasowych nazywa się dipeptydami. Dzięki obecności aktywnej grupy karboksylowej i aminowej mogą one kondensować z następnymi aminokwasami i tworzyć w ten sposób związki zbudowane z trzech (tripeptydy), dziesięciu (oligopeptydy) lub większej liczby jednostek aminokwasowych (polipeptydy). Polipeptydy zbudowane z ponad stu reszt aminokwasowych nazywa się białkami.

Peptydy zbudowane są najczęściej z reszt różnych aminokwasów. Są to tzw. heteropeptydy. Cząsteczki zawierające reszty tych samych aminokwasów określa się mianem homopeptydów.

Inny podział uwzględnia kształt cząsteczki i wyróżnia peptydy liniowe oraz cykliczne.


Wykrywanie i rozdział peptydów

Istnieje wiele charakterystycznych reakcji pozwalających określić obecność peptydów w mieszaninie innych substancji. Wyróżnia się wśród nich:

- reakcję ninhydrynową - w której pod wpływem ninhydryny aminokwasy ulegają utlenieniu, dekarboksylacji oraz deaminacji. Przejściowo powstaje zredukowana ninhydryna i iminokwas ulegający przekształceniu w aldehyd uboższy o jeden atom węgla. Uwalnia się CO2 i amoniak, w obecności którego zredukowana i utleniona cząsteczka ninhydryny ulegają reakcji kondensacji. W ten sposób powstaje fioletowo-niebieski produkt zwany purpurą Ruhemanna. Intensywność i odcień powstającego zabarwienia zależą od rodzaju aminokwasu. Test znalazł zastosowanie m.in. w kryminalistyce podczas wykrywania odcisków palców;

- reakcję ksantoproteinową - służącą do wykrywania aminokwasów aromatycznych, które ulegając nitrowaniu kwasem azotowym (V) tworzą pochodne o żółtym zabarwieniu;

- reakcję biuretową (piotrowskiego) - pozwalającą wykrywać obecność więcej niż dwóch wiązań peptydowych w cząsteczce. W środowisku silnie zasadowym wiązania te kompleksują kationy miedzi (II) i zmieniają w ten sposób barwę roztworu z jasnoniebieskiej na intensywnie fioletową;

- denaturację przeprowadzaną za pomocą podwyższonej temperatury, obecności alkoholi jednowodorotlenowych takich jak metanol lub etanol, formaliny i soli metali ciężkich powodujących nieodwracalne ścinanie się białek.

Złożoną mieszaninę peptydów, różniących się od siebie nieznacznie masą i rozpuszczalnością można rozdzielić za pomocą filtracji na żelu, elektroforezy na żelu poliakrylamidowym lub wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC).


Skład aminokwasowy i sekwencja aminokwasów w peptydach i białkach

Pierwszym zsekwencjonowanym peptydem była insulina. Dokonał tego w XX w. Fred Sanger, a za swoje odkrycie otrzymał Nagrodę Nobla. Od tego czasu wprowadzono nowe techniki oznaczania struktury pierwszorzędowej polipeptydów.

Wśród nich wyróżnić można degradację Edmana, czyli metodę automatycznego i kolejnego usuwania z peptydów N-końcowych reszt aminokwasowych. Powstające w ten sposób pochodne fenylotiohydantoinowe aminokwasów można poddawać identyfikacji za pomocą technik chromatografii. Metoda ta pozwala na określenie sekwencji peptydu złożonego z dziesięciu reszt aminokwasowych. Sekwencję dużych peptydów i białek oznacza się na podstawie sekwencji ich fragmentów otrzymanych za pomocą częściowej hydrolizy chemicznej lub enzymatycznej.

Kolejność aminokwasów w peptydzie można też określić oznaczając sekwencję nukleotydową kodujących go genów. Metoda ta nie dostarcza jednak jednoznacznych wyników o pierwszorzędowej strukturze białek, a jedynie danych na temat nieobrobionego produktu, jaki powstał w trakcie syntezy na rybosomach. Wnioskowanie o pełnej strukturze pierwszorzędowej polipeptydu wymaga sekwencjonowania nakładających się peptydów.

Obie powyższe metody wzajemnie się uzupełniają i mogą być przeprowadzane równocześnie.

W celu poznania struktury peptydu stosuje się również osobne oznaczanie jego aminokwasów N-terminalnych (N- arylowanie niepodstawionej grupy aminowej końcowego aminokwasu) i C-terminalnych (hydrazynoliza, czyli rozkład za pomocą hydrazyny).


Synteza peptydów

Pierwszą udaną syntezę peptydu - glicyloglicyny przeprowadzili w 1901 r. E. Fisher i E. Fourneau.

Reakcja ta przez długi czas sprawiała chemikom poważne trudności, których przyczyną była obecność w każdym aminokwasie aktywnych grup aminowych i karboksylowych. Tworzące się peptydy wchodziły w dalsze reakcje i w ten sposób w środowisku reakcji tworzyły się mieszaniny wielu produktów, z których trudno było wydobyć poszczególne składniki. Problem ten rozwiązano z pomocą czasowego osłaniania funkcji aminowej aminokwasu arylującego i karboksylowej aminokwasu arylowanego. Osłony grup funkcyjnych dobiera się w taki sposób, aby umożliwić ich selektywne lub równoczesne usunięcie. Odczynnikiem usuwającym większość osłon peptydowych jest ciekły fluorowodór.

Do otrzymania dipeptydu z odpowiednio chronionych aminokwasów należy zastosować odczynnik aktywujący grupę karboksylową aminokwasu arylującego, taki jak np. DCC, czyli dicykloheksylokarbodiid. Można również przeprowadzić aminokwas acylujący w bezwodnik lub zastosować inną metodę aktywacji.

Większe peptydy otrzymuje się zwykle z dipeptydu poprzez usunięcie osłony grupy aminowej aminokwasu N-terminalnego i acylowanie go kolejnym N-chronionym aminokwasem. Czynności te powtarza się aż do momentu uzyskania peptydu o zaplanowanej sekwencji. Ten pracochłonny sposób nazywany jest metodą „krok po kroku” (ang. step by step). Może on zostać usprawniony dzięki łączeniu ze sobą gotowych, dłuższych fragmentów, których jednoczesne przygotowywanie znacznie skraca czas reakcji. Oba te sposoby określa się mianem klasycznych metod syntezy peptydów w roztworze.

Duże peptydy najłatwiej otrzymuje się za pomocą metody Merifielda, przeprowadzanej na fazie stałej. C-końcowy aminokwas przytwierdza się do polimeru, stanowiącego osłonę grupy karboksylowej. Następnie przyłącza się kolejne aminokwasy, aż do momentu, w którym osiągnięta zostanie pożądana długość łańcucha. Rosnący peptyd jest dzięki temu przez cały czas w jednym i tym samym naczyniu, do którego wprowadzane są roztwory odpowiednich reagentów oraz rozpuszczalniki usuwające produkty uboczne. Umożliwia to automatyzację wszystkich czynności. Po zakończeniu syntezy peptydu, zdejmuje się go z polimerycznego nośnika i poddaje obróbkom.


Peptydy naturalne

Organizmy żywe wytwarzają różnorodne związki organiczne, w tym również wiele peptydów. Mogą być one zbudowane zarówno z aminokwasów białkowych, jak i niebiałkowych. Dodatkowo mikroorganizmy mogą wytwarzać peptydy zawierające w swoich cząsteczkach aminokwasy o konformacji D. Nie są one jednak syntetyzowane w rybosomach. Niektóre peptydy i białka wirusowe znalazły zastosowanie w produkcji szczepionek.

Znane są także cząsteczki zbudowane nie tylko z aminokwasów, ale także z reszt innych związków, np. hydroksykwasów (takie peptydy nazywa się depsipeptydami), cukrów (glikopeptydy), lipidów (lipopeptydy) lub estryfikowane kwasem fosforowym – fosfopeptydy.

Wiele małocząsteczkowych peptydów występujących w komórkach roślin, bakterii i zwierząt wykazuje aktywność fizjologiczną. Należą do nich między innymi:

glutation (GSH), czyli związek biorący udział w reakcjach redoks i niezbędny do działania niektórych enzymów. Jest on nietypowym tri peptydem zbudowanym z reszty kwasu glutaminowego, cysteiny i glicyny;

tyreoliberyna (TRF), tripeptyd występujący w podwzgórzu i stymulujący aktywność niektórych hormonów takich jak prolaktyna, tyreotropina, wazopresyna, hormon wzrostu, insulina oraz licznych neuroprzekaźników;

peptydy opioidowe (enkefaliny, endorfiny), które mimo różnicy w budowie chemicznej, wykazują aktywność biologiczną zbliżoną do właściwości opium;

neuropeptydy, czyli neropeptydy wytwarzane w tkance nerwowej, peptydowe hormony tkankowe i hormony gruczołowe;

peptydy toksyczne m.in. toksyny grzybów, jady węży, niektóre antybiotyki.




Tab.1 Aminokwasy białkowe i ich symbole


Autor: Anna Kurcek


Literatura:
1. Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V. W., 1995. Biochemia Harpera. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa.
2. Jakubke H. D., Jeschkeit H., 1982. Aminokwasy peptydy białka. Państwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszawa.
3. Soczewka J.,1994. Chemia. Vademecum Maturzysty. Wydawnictwo „OŚWIATA”, Warszawa.
4. Kołodziejczak A., 2006. Aminokwasy i peptydy.


Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

81 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u