biotechnologia


 
 

SDS-PAGE

SDS PAGE IBB PAN PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Fragment skryptu: Biologia molekularna roślin

Uniwersytet Warszawski (www)
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN (www)
Zakład Biologii Molekularnej Roślin (www)
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

Adres:
ul. Pawińskiego 5a,
02-106 Warszawa

Kontakt: tel. (+48 22) 592 5704,
E-mail: andyj@ibb.waw.pl


Zakład Biologii Molekularnej Roślin

Problematyka badawcza: Rola struktury chromatyny w regulacji rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na czynniki stresowe i hormonalne. Prowadzone aktualnie badania mają na celu poznanie funkcji roślinnych kompleksów remodelujących chromatynę, histonu H1 i modyfikacji potranslacyjnych histonów rdzeniowych, a także opisanie proteomu jądrowego rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.
Stosowane techniki: Większość metod biologii molekularnej, metody biochemii białek, analiza proteomiczna (mass-spec) i transkryptomiczna (mikromacierze), genetyka Arabidopsis thaliana (konstrukcja i analiza mutantów), metody bioinformatyczne.
_______________________________________________________________________________


Najpowszechniej stosowaną techniką elektroforetycznego rozdziału białek w żelach poliakrylamidowych jest elektroforeza w obecności SDS, tzw. SDS-PAGE. SDS (siarczan dodecylu sodu) jest silnym detergentem anionowym, który niszczy struktury białkowe wyższego rzędu, denaturując białka do postaci liniowej (struktura pierwszorzędowa) oraz nadaje im wypadkowy ładunek ujemny.


Elektroforeza SDS-PAGE


Przyjmuje się, że statystycznie jeden anion dodecylosiarczanowy przypada na dwie reszty aminokwasowe. Ponadto do rozdzielanych próbek dodaje się silne środki redukujące, takie jak 2-merkaptoetanol lub DTT, które redukują mostki disiarczkowe obecne w białkach. Można więc przyjąć, że tempo migracji białek podczas elektroforezy SDS-PAGE jest zależne tylko od ich masy i jest wprost proporcjonalne do jej logarytmu. Oczywiście są białka, dla których występują odstępstwa od tej reguły i ich migracja ulega zaburzeniu. Zaliczają się do nich białka obdarzone wysokim ładunkiem natywnym (np. białka histonowe, migrujące wolniej niż wskazywałaby na to ich masa) oraz białka błonowe. Jednakże dla większości białek tempo migracji jest zależne tylko od masy. Dlatego też możliwe jest stosowanie tzw. standardów wielkości białek.

Standardy wielkości są mieszaniną kilku lub kilkunastu białek o znanej masie. Po ich równoległym rozdziale razem z analizowaną próbką możliwe jest oszacowanie masy badanych białek. Dla większość białek błąd w szacowaniu wielkości mieści się w granicach 5 do 10%.


Rozdział SDS-PAGE


Rozdział SDS-PAGE prowadzony jest na ogół techniką nieciągłego żelu. Jako buforu elektroforetycznego standardowo używa się układu tris-glicyna (tzw. układ Leammli’ego), w którym pH żelu zatężającego wynosi 6,6, zaś żelu rozdzielającego 8,8. Jonami zaangażowanymi w zagęszczanie analizowanych białek w żelu zatężającym są aniony chlorkowe i glicynianowe. pH żelu zatężającego jest nieznacznie wyższe niż pI glicyny. W tych warunkach większość glicyny występuje w postaci jonów obojnaczych, posiadających zerowy wypadkowy ładunek elektryczny i nie migrujących w polu elektrycznym. Tylko niewielka ich część posiada w danym momencie sumaryczny ładunek ujemny i migruje w kierunku anody (elektroda +). Anion glicynianowy migruje więc powoli jako tzw. „jon opóźniony” (ang. trailing ion). Natomiast aniony chlorkowe, posiadające wysoką ruchliwość elektroforetyczną, przemieszczają się szybko w kierunku anody wraz z czołem próbki jako tzw. „jon wiodący” (ang. leading ion). Rozdzielenie się dwóch „chmur” jonów powoduje spadek napięcia pomiędzy nimi, w wyniku czego zawarte między nimi białka ulegają silnej kondensacji w bardzo wąskim paśmie. Dzięki temu wszystkie białka wchodzą w żel rozdzielający praktycznie w tym samym czasie.

W żelu zatężającym stosuje się na tyle niskie stężenie poliakrylamidu, aby nie zaburzał on migracji białek. Jego funkcja sprowadza się do ograniczania dyfuzji molekuł i hamowania ruchów konwekcyjnych. Po dotarciu próbki do żelu rozdzielającego dochodzi do gwałtownej zmiany w otoczeniu migrujących białek. Ponieważ pH żelu rozdzielającego jest znacznie powyżej pI glicyny (pH = 8,8), praktycznie całość glicyny ulega deprotonacji i jako aniony wyprzedza białka. Powoduje to zanik miejscowego spadku napięcia. Od tej pory białka migrują w tempie zależnym od ich masy.


Wady elektroforezy SDS-PAGE


Technika elektroforetyczna SDS-PAGE prowadzona w układzie Leammli’ego, mimo iż jest bardzo powszechnie stosowana, nie jest wolna od wad. Pierwsza z nich wynika z faktu, iż pH żelu rozdzielającego jest zasadowe (pH=8,8). Zasadowy odczyn promuje powolną hydrolizę żelu, prowadzącą do słabszego usieciowania żelu i w konsekwencji spadku zdolności rozdzielczej, co sprawia, że żele SDS-PAGE nie mogą być przechowane dłużej niż 1-2 miesiące. Zasadowe środowisko elektroforezy promuje również tworzenie się mostków disiarczkowych, zaś odczynniki redukujące, takie jak 2-merkaptoetanol lub DTT, nie migrują wraz z białkami, co również może mieć negatywny wpływ na rozdział białek. Ponadto, wraz z przebiegiem elektroforezy, pH żelu rozdzielającego rośnie do wartości powyżej 9,5, co sprzyja zachodzeniu reakcji ubocznych, takich jak deaminacja białek oraz addycja niespolimeryzowanego akrylamidu do grup aminowych i tiolowych w łańcuchach bocznych aminokwasów.

Zachodzące modyfikacje białek mogą utrudniać dalszą ich analizę technikami spektrometrii mas. Kolejną wadą układu Leammli’ego jest wysoka temperatura podczas denaturacji próbek białek, mogąca prowadzić do hydrolizy wiązania peptydowego pomiędzy kwasem asparaginowym a proliną. Zaletą tradycyjnej techniki SDS-PAGE jest natomiast niska cena stosowanych odczynników.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

128 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u