biotechnologia


 
 

Szybkie testy immunochromatograficzne

Wśród wszelkich nowoczesnych technologii na szczególną uwagę zasługują szybkie testy immunochromatograficzne, inaczej nazywane szybkimi testami diagnostycznymi (ang. rapid diagnostic tests). Być może nie są tak doceniane w naukowym środowisku, jak metoda PCR czy testy ELISA, a jednak mimo to znajdują coraz częściej zastosowanie w diagnostyce.

Służą one jako użyteczne narzędzie diagnostyczne zarówno w medycynie, jak i weterynarii, ale także w rolnictwie, przemyśle spożywczym czy ochronie środowiska. Obecnie zyskują coraz większą przewagę nad innymi metodami diagnostycznymi, takimi jak tradycyjne testy laboratoryjne, przede wszystkim ze względu na krótki czas w jakim uzyskujemy wynik, czy też prostotę wykonania, nie wymagającą dodatkowego sprzętu i odczynników, a w wielu przypadkach także niższy koszt pojedynczego badania.

Historia testów immunochromatograficznych sięga lat 60. XX w., kiedy to pierwszy raz została opisana technologia leżąca u podstaw ich działania, natomiast pierwszym komercyjnym produktem wprowadzonym na rynek był test ciążowy firmy Unipath Clearview w 1988 roku. W przypadku tej technologii okazało się, że pozornie skomplikowana metoda jest prosta i każdy może z niej skorzystać. Od tego momentu zaczęto produkować testy diagnostyczne o wszechstronnym zastosowaniu na większą skalę.

W zależności od rodzaju testu różnią się one między sobą, jednak podstawowa zasada na której opiera się ich działanie, jest zawsze taka sama - wykorzystują unikalną zdolność przeciwciał do wybiórczego wiązania z konkretną cząsteczką lub grupą podobnych cząsteczek (antygenem).

Są nieskomplikowanym narzędziem przeznaczonym do detekcji obecności (lub jej braku) danego komponentu badanej próby, jak chociażby obecności wirusa w analizowanej próbce krwi. Badanie przy użyciu tych testów jest możliwe z wykorzystaniem różnego rodzaju materiału - krwi pełnej, osocza, surowicy, kału, moczu, potu, płynu mózgowo- rdzeniowego, a nawet łez.


Przeciwciała narzędziem diagnostycznym


Przez lata intensywnego rozwoju nauk medycznych opracowanych zostało wiele metod, które służą do analizy antygenów lub przeciwciał, między innymi testy immunochromatograficznie, których zasada działania opiera się na prostym połączeniu przeciwciała z białkowym antygenem.

Podstawową cechą każdego przeciwciała jest powinowactwo, definiowane jako siła, z jaką wiązany jest antygen.



Ryc.1 Ogólny schemat przedstawiający powinowactwo przeciwciała i antygenu.
Źródło: http://pl.wikipedia.org/wiki/Przeciwciało

Przeciwciała monoklonalne


Do produkcji szybkich testów immunochromatograficznych wykorzystywane są przede wszystkim przeciwciała monoklonalne.

Historia otrzymywania przeciwciał monoklonalnych sięga roku 1975, kiedy to Köhler i Milstein opracowali metodę ich wytwarzania. Naukowcy za to odkrycie otrzymali nagrodę Nobla w kategorii fizjologii i medycyny w 1984 roku. Ich technika pozwala na wytworzenie linii komórkowych, które produkują monoklonalne przeciwciała (mAb) o tylko jednym rodzaju swoistości.

Większość mAb stanowią przeciwciała mysie, jednak ze względu na problemy z ich stosowaniem produkuje się tzw. humanizowane przeciwciała mysie (poprzez nadawanie przeciwciałom mysim cech przeciwciał ludzkich).

Technika Köhlera i Milsteina uległa standaryzacji i obecnie wykorzystywana jest na dużą skalę w medycynie do produkcji przeciwciał używanych w diagnostyce laboratoryjnej i klinicznej.


Budowa testów


Typowe, spotykane na rynku medycznym testy występują najczęściej w formie płytek, zazwyczaj plastikowych. Na powierzchni płytki znajdują się: okienko do nanoszenia kropli badanej substancji, linia kontrolna (która pojawia się, gdy test działa poprawnie) oraz linia badana. Wewnątrz zestawu testowego mieści się pasek, składający się z czterech części: części próbkowej, części zawierającej koniugat, papierka testowego (nitrocelulozowa membrana) i części absorbującej (chłonnej). Testy są tak zaprojektowane i skonstruowane, aby wykrywały konkretne i specyficzne antygeny.



Ryc.2 Budowa płytki testowej.
Źródło: http://www.indica.fr/pages/en/8/rapid-tests.html

Zasada działania testu


Zasada działania testu bazuje na metodzie immunologicznej. Kropla badanej substancji najpierw przemieszcza się wzdłuż błony nitrocelulozowej z wykorzystaniem zjawisk kapilarnych. W teście umiejscowione są specyficzne przeciwciała, najczęściej w kompleksie ze złotem koloidalnym. Po wchłonięciu próby przez membranę, antygen (jeśli próba okaże się pozytywna) wiąże się z kompleksem koloidalnego złota i odpowiednich przeciwciał.

Efektem tej reakcji jest uformowanie się kompleksu, który zostaje wykryty przez test. Interpretacja wyników polega na potwierdzeniu lub wykluczeniu obecności antygenów w badanej próbce na podstawie obserwacji pojawiających się barwnych pasków.

Pojawienie się kresek w obu miejscach - kontrolnym i wynikowym, świadczy o pozytywnym wyniku, co jest widoczne na poniższej rycinie:



Ryc.3 Zestaw testowy wykrywający przecinkowca cholery, po lewej wynik pozytywny, po prawej- negatywny.
Źródło: http://rapid-tests.net

Zasada metody immunochromatograficznej jest porównywana z testem ELISA, z tą jednak różnicą, że reakcja immunologiczna przebiega na papierze chromatograficznym (membranie nitrocelulozowej) z wykorzystaniem zjawisk kapilarnych, a w metodzie ELISA reakcja ma miejsce na płytce z 96 dołkami (pełniącymi funkcję mikroprobówek), opłaszczonymi przeciwciałem lub antygenem, w zależności od rodzaju testu.

W metodzie immunochromatograficznej zwykle wykorzystywane są 2 rodzaje specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenowi, przy czym jedno z nich jest unieruchamiane na celulozowej membranie, drugie natomiast jest znakowane koloidalnym złotem i przenika na powierzchnię testową.

Naniesienie kropli testowanej substancji prowadzi do uformowania immunokompleksu antygenu obecnego w próbie ze znakowanym przeciwciałem. Kompleks „porusza się” wraz z płynną próbką i dochodzi do kontaktu z immobilizowanym na membranie przeciwciałem. W konsekwencji szeregu reakcji na teście uwidacznia się kolorowa linia lub punkt.



Ryc.4 Schematycznie zobrazowany przebieg reakcji w zestawie testowym.

Źródło: http://bl-inc.jp/imno_e.html


Zastosowanie szybkich testów w różnych gałęziach działalności ludzkiej


W miarę rozwoju metody szybkich testów znalazły one zastosowanie w wielu różnych obszarach działalności ludzkiej. Prawdopodobnie najpopularniejsze są testy ciążowe, pozwalające wykryć w moczu hCG, czyli gonadotropinę kosmówkową, wydzielaną przez trofoblast gdy dojdzie do zapłodnienia, a także testy owulacyjne. Obecnie coraz większą popularność zdobywają testy wykrywające wirusa HIV.

Innego typu zestawy testowe umożliwiają m.in. wykazanie podwyższonego stanu troponin w osoczu (co może świadczyć o takich stanach, jak udar mózgu, zapalenie wsierdzia, czy zapalenie mięśnia sercowego). Na rynku szeroko dostępne są testy na obecność narkotyków (kokainy, heroiny, marihuany). Coraz powszechniej stosowane są też testy wykrywające malarię, a także wiele innych chorób o podłożu bakteryjnym czy wirusowym.

Oprócz testów mających zastosowanie ściśle medyczne można wymienić m.in. testy wykrywające broń biologiczną (np. toksyny). Testy immunochromatograficzne są stosowane również w ochronie środowiska (np. badające czystość mikrobiologiczną wody) oraz w ocenie żywności. Co ciekawe, opracowany został nawet test wykazujący obecność grzyba Botrytis cinerea w winogronach, z którym to patogenem zmagają się producenci win.


Zastosowanie w praktyce weterynaryjnej


W medycynie weterynaryjnej stosuje się testy zarówno do badań zwierząt gospodarskich (krów, drobiu, owiec, świń) jak i zwierząt domowych, głównie psów i kotów. Stosowane są testy wykrywające bakterie, wirusy, choroby alergiczne, ale także badające np. zdolność do rozrodu.

Obecnie rynek weterynaryjny jest zdominowany przez testy dla zwierząt towarzyszących (ok. 60% wszystkich szybkich testów), są to testy na anemię, raka, oceniające poziom hormonów, testy w kierunku wirusów (adenowirusy, koronawirusy, parwowirusy, rotawirusy i inne), czy na obecność bakterii i pasożytów (E.coli, dirofilarioza, borelioza, tasiemce i inne).

W związku z faktem, że zdrowie zwierząt gospodarskich przekłada się na zdrowie i życie ludzi, coraz częściej stosuje się diagnostykę tych zwierząt obejmującą rozpoznawanie pryszczycy, gruźlicy bydła, ptasiej grypy, wykrywanie wąglika, choroby „szalonych krów” (BSE), wirusa zachodniego Nilu, a także testy określające płodność krów czy klaczy.


Zalety szybkich testów


Specyficzne właściwości testów immunochromatograficznych sprawiają, że wyróżniają się one na tle innych metod diagnostycznych, a nawet w przypadku rozpoznawania niektórych chorób stopniowo je wypierają - jak chociażby coraz powszechniej stosowane w weterynarii szybkie testy w kierunku Borrelia burgdorferi.

1) Czas potrzebny na uzyskanie wyniku:
Czas odczytu dla większości testów wynosi od 5 do 10 minut, podczas gdy w przypadku np. testu ELISA jest to dłuższa i skomplikowana procedura. Dodatkowy czas zajmuje tylko pobranie materiału do badania.

2) Wygoda i prostota używania i wykonania:
Do każdego testu dołączona jest czytelna ulotka z instrukcją obsługi i każdy może taką analizę przeprowadzić samodzielnie, ponieważ nie wymaga to szczególnych umiejętności czy kwalifikacji.

3) Używanie w warunkach domowych:
Testy immunochromatograficzne mogą być bez jakichkolwiek przeciwwskazań używane w warunkach domowych - nie wymagają sterylnego środowiska czy kontrolowanej temperatury, jakie można uzyskać tylko w specjalnym laboratorium. Co więcej, niepotrzebny jest żaden dodatkowy sprzęt czy droga aparatura specjalistyczna. Wszystkie niezbędne do wykonania testu elementy znajdują się w zakupionym zestawie.

4) Szeroki wachlarz wykorzystania:
Do tej pory testy immunochromatograficzne znalazły zastosowanie w diagnostyce chorób ludzi, zwierząt, jak również w badaniach żywności, w rolnictwie czy ochronie środowiska.

5) Jednoznaczny wynik:
Wynik, który odczytujemy, jest wyraźny i nie pozostawiający wątpliwości, oceniamy go jako pozytywny, negatywny lub nieważny (wtedy badanie należy powtórzyć). Odczytu dokonuje się „gołym okiem”.

6) Niewielka ilość materiału do badania:
Zwykle wystarczy zaledwie kropla badanego materiału.

7) Różnorodny materiał wykorzystywany do badania:
Do badań wykorzystywany jest bardzo różnorodny materiał, poczynając od krwi pełnej, poprzez osocze, surowicę, kał, mocz, pot, płyn mózgowo-rdzeniowy, aż po łzy.

8) Okres przydatności testu do użycia:
Spośród cech typowo użytkowych na uwagę zasługuje długi okres przydatności do użycia (zwykle jest to 18 miesięcy od daty produkcji) i stabilność - można je przez długi czas przechowywać w temperaturze od 2 do 30°C i transportować bez konieczności zachowania szczególnych warunków.
W porównaniu z innymi metodami diagnostycznymi, szybkie testy charakteryzuje bardzo wysoka czułość i swoistość.


Podsumowanie


Można przypuszczać, że w przyszłości szybkie testy umożliwią łatwiejszą i szybszą diagnostykę wielu chorób, bez konieczności przeprowadzania żmudnych i skomplikowanych badań. Mogłoby to ograniczyć czas oczekiwania na wyniki i przyspieszyć decyzję odnośnie prawidłowego leczenia. Być może ta niepozorna metoda zyska więcej zwolenników i zostanie doceniona. Taką tendencję już dziś można zauważyć chociażby w gabinetach weterynaryjnych, gdzie szybkie testy są coraz bardziej popularne i powszechnie stosowane.


Autor: Kamila Mazur
Studentka Biotechnologii, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie


Literatura:
1. Adaszek Ł. Kalinowski M., Kutrzuba J., Winiarczyk S., Ziętek J., Trudności w diagnostyce boreliozy u psów, w: Życie Weterynaryjne 2010, nr 5, str. 414-417
2. Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W., Immunologia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006, str. 45-47
3. Lydygard P.M., Whelan A., Fanger M.W., Krótkie wykłady- Immunologia, PWN, Warszawa 2005, str. 93, 131, 321-323
4. Schmitz S., Coenen C., König M. i in., Comparision od three rapid commercial Canine parvovirus antigen detection tests with electron microscopy and polymerase chain reaction, w: Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 2009, nr 21, str. 344-345
5. Oh J.-S., Ha G-W., Cho Y-S. i in., One Step Immunochromatography Assay Kit for Detecting Antibodies to Canine Parvovirus, w: Clinical and Vaccine Immunology Vol.13 2006, str. 520-524
6. www.en.wikipedia.org/wiki/Lateral_flow_test
7. www.rapidmicrobiology.com


Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

245 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u