PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Fragment skryptu: Biologia molekularna roślin
Uniwersytet Warszawski (www)
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN (www)
Zakład Biologii Molekularnej Roślin (www)
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski
Adres:
ul. Pawińskiego 5a,
02-106 Warszawa
Kontakt: tel. (+48 22) 592 5704,
E-mail: andyj@ibb.waw.pl
Zakład Biologii Molekularnej Roślin
Problematyka badawcza: Rola struktury chromatyny w regulacji rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na czynniki stresowe i hormonalne. Prowadzone aktualnie badania mają na celu poznanie funkcji roślinnych kompleksów remodelujących chromatynę, histonu H1 i modyfikacji potranslacyjnych histonów rdzeniowych, a także opisanie proteomu jądrowego rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.
Stosowane techniki: Większość metod biologii molekularnej, metody biochemii białek, analiza proteomiczna (mass-spec) i transkryptomiczna (mikromacierze), genetyka Arabidopsis thaliana (konstrukcja i analiza mutantów), metody bioinformatyczne.
_______________________________________________________________________________
Podobnie jak SDS-PAGE, elektroforeza białek w żelach poliakrylamidowych w obecności mocznika (Urea-PAGE) jest techniką denaturującą białka. Podobnie jak SDS, mocznik niszczy struktury białkowe wyższego rzędu, jednakże nie wpływa on na sumaryczny ładunek elektryczny białka. Tempo migracji białek zależy więc zarówno od ich masy jak i ładunku. Technika ta bywa stosowana jako alternatywa dla SDS-PAGE podczas rozdziału białek błonowych, które mimo obecności SDS pozostają w formie nierozpuszczonej.
Modyfikacje metody Urea-PAGE
Modyfikacją metody Urea-PAGE jest AU-PAGE (ang. Acidic Urea PAGE), czyli elektroforeza białek w obecności mocznika i kwasu octowego. Technika ta pozwala na rozdział elektroforetyczny białek o właściwościach zasadowych, głównie histonów. Niskie pH buforów używanych podczas elektroforezy (pH = 3) sprawia, że analizowane białka występują w formie protonowanej, zaś wielkość wypadkowego dodatniego ładunku elektrycznego zależy od liczby reszt aminokwasów zasadowych (głównie arginin i lizyn).
Ponieważ białka występują w postaci kationów, rozdział elektroforetyczny prowadzi się w kierunku katody (elektroda „-”). W technice AU-PAGE tempo migracji zależy zarówno od ładunku jak i masy danego białka. Wrażliwość na sumaryczny ładunek białka jest tak wysoka, że nawet utrata jednej grupy funkcyjnej o charakterze zasadowym (np. w wyniku modyfikacji potranslacyjnych, takich jak acetylacja lizyny) lub uzyskanie grupy funkcyjnej o wyraźnych właściwościach kwasowych (np. w wyniku fosforylacji seryny) może, w przypadku niektórych małych białek (np. histonu H4), być widoczna w postaci wyraźnego przesunięcia prążka na żelu.
Technikę AU-PAGE można stosować w formie układu nieciągłego (analogami anionów chlorkowego i glicynianowego są odpowiednio kation amonowy i kation glicyniowy) lub ciągłego (stosowane dla bardzo małych białek i peptydów lub białek które nie ulegają rozdziałowi po zatężeniu). Podczas rozdziału w układzie ciągłym, przed właściwą elektroforezą przeprowadza się tzw. pre-elektroforezę, czyli przykłada się napięcie do „pustego” żelu w celu usunięcia z niego kationów amonowych, które powodowałyby zatężanie próbki.
Polimeryzacja żeli w AU-PAGE
Czynnikami inicjującym polimeryzację żeli do AU-PAGE mogą być układy APS/TEMED lub ryboflawina/TEMED. Stosowanie APS jest jednak kłopotliwe, ponieważ w warunkach niskiego pH kataliza rozkładu APS przez TEMED jest mało wydajna, co prowadzi do długotrwałej polimeryzacji żelu. Ponadto, obecność jonów powstałych w wyniku rozkładu APS zaburza zatężanie białek w układach nieciągłych. W układzie ryboflawina/TEMED polimeryzacja jest indukowana przez promienie UV lub silne źródło światła.
