biotechnologia


 
 

Western Blot

Western Blot IBB PAN PRZEDRUK, oryginał dostępny pod adresem www
Fragment skryptu: Biologia molekularna roślin

Uniwersytet Warszawski (www)
Instytut Biochemii i Biofizyki PAN (www)
Zakład Biologii Molekularnej Roślin (www)
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. Andrzej Jerzmanowski

Adres:
ul. Pawińskiego 5a,
02-106 Warszawa

Kontakt: tel. (+48 22) 592 5704,
E-mail: andyj@ibb.waw.pl


Zakład Biologii Molekularnej Roślin

Problematyka badawcza: Rola struktury chromatyny w regulacji rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na czynniki stresowe i hormonalne. Prowadzone aktualnie badania mają na celu poznanie funkcji roślinnych kompleksów remodelujących chromatynę, histonu H1 i modyfikacji potranslacyjnych histonów rdzeniowych, a także opisanie proteomu jądrowego rośliny modelowej Arabidopsis thaliana.
Stosowane techniki: Większość metod biologii molekularnej, metody biochemii białek, analiza proteomiczna (mass-spec) i transkryptomiczna (mikromacierze), genetyka Arabidopsis thaliana (konstrukcja i analiza mutantów), metody bioinformatyczne.
_______________________________________________________________________________


Technika western blot wykorzystywana jest do detekcji i identyfikacji białek. Procedura składa się z kilku części. Pierwszym etapem jest rozdzielenie mieszaniny białek w żelu poliakrylamidowym. Następnie białka przenoszone są na membranę (w naszym przypadku jest do transfer pół-suchy), która niespecyficznie wiążą wszystkie białka. Transfer odbywa się w kierunku elektrody dodatniej. Po rozdziale elektroforetycznym w obecności SDS-u (jonowego, naładowanego ujemnie, detergentu) białka są zdenaturowane i wszystkie posiadają ładunek ujemny proporcjonalny do ich masy. Wszystkie zatem będą wędrować w kierunku elektrody dodatniej. Należy zatem tak ułożyć membranę względem żelu, by znalazła się ona na drodze migracji białek z żelu. Wyróżniamy dwa typy transferu: transfer mokry i półsuchy.


Transfer mokry (Western Blot)


W metodzie tej „kanapka” złożona z żelu, membrany i bibuły Whatmana ułożona jest pionowo pomiędzy dwiema elektrodami. Całość umocowana jest w aparacie wypełnionym buforem. W niektórych typach aparatów można umieścić i prowadzić transfer dla czterech takich „kanapek” jednocześnie. Transfer mokry zalecany jest w przypadku białek dużych (>100 kDa), hydrofobowych lub trudno rozpuszczalnych ze względu na możliwość prowadzenia go nawet przez 24 godziny, bez ryzyka wyparowania buforu. Należy jednak pamiętać, że przy transferach trwających dłużej niż godzinę, trzeba zapewnić chłodzenie, aby utrzymać temperaturę w granicach 10 – 30°C. Transfer mokry przeprowadza się przy stałym napięciu prądu, zwykle 20 – 30 V. Konieczność chłodzenia, jak również duża ilość buforu niezbędna do przeprowadzenia transferu są niewątpliwie wadami tej metody.


Transfer pół-suchy (Western Blot)


Drugi rodzaj transferu to transfer półsuchy. W tym przypadku „kanapka” ułożona jest poziomo i znajduje się między płaskimi elektrodami. Żel i membrana umieszczone są pomiędzy bibułami nasączonymi buforem. Ze względu na to, że cały dostarczany prąd przechodzi przez membranę, transfer ten jest szybszy niż transfer mokry. Prowadzi się go przy stałym natężeniu prądu, wynoszącym zwykle 1 – 1,5 mA/cm2 membrany. Kolejną zaletą jest niewielka ilość buforu potrzebna do przeprowadzenia transferu, nie jest też konieczne chłodzenie. Ze względu na możliwość wyparowania buforu, nie należy prowadzić transferu dłużej niż trzy godziny. W przypadku białek dużych lub trudno rozpuszczalnych, wymagających długiego transferu, zaleca się transfer mokry.

Transfer białek z żelu można przeprowadzić na różnego typu membrany. Najpopularniejsze z nich to membrany nitrocelulozowe lub membrany z polifluorku winylidenu (PVDF). Membrany nitrocelulozowe są niezbyt drogie, a ich zdolność do wiązania białek jest wysoka (249 μg/cm2). Wielkość porów w membranach nitrocelulozowych waha się od 0,45 μm do 0,1 μm, dzięki czemu można transferować małe białka, tj. poniżej 1500 Da. Membrany te od razu nasącza się buforem do transferu, bez uprzedniego zanurzania ich w metanolu. Membrany PVDF charakteryzują się nieco mniejszą zdolnością do wiązania białek w porównaniu do membran nitrocelulozowych (172 μg/cm2), mają one za to dużo większą wytrzymałość mechaniczną. Należy pamiętać o wcześniejszym zanurzeniu ich w metanolu i dopiero później w buforze do transferu (aktywacja membrany). Membran PVDF można używać kilkakrotnie - po ich wywołaniu, można wypłukać przeciwciała I i II-rzędowe, a następnie powtórnie zablokować w mleku i powtórzyć inkubację z innymi przeciwciałami I-, a następnie II-rzędowymi.


Blokowanie membran (Western Blot)


Po transferze wolne miejsca wiązania białek na membranie są blokowane, aby zapobiec niespecyficznej adsorpcji przeciwciał. Do blokowania membran najczęściej używa się odtłuszczonego mleka lub albuminy z surowicy cielęcej.


Wiązanie przeciwciał (Western Blot)


Antygeny będące przedmiotem badań identyfikuje się przy użyciu wyznakowanych przeciwciał, bądź przeciwciał niewyznakowanych a identyfikowanych poprzez wyznakowane przeciwciała drugorzędowe specyficzne dla pierwszorzędowych. W końcu następuje detekcja, której sposób zależy od rodzaju użytych przeciwciał.


Detekcja białek (Western Blot)


Metoda detekcji białek w technice western blot zależy od rodzaju znacznika, jaki dołączony jest do przeciwciał. Najczęściej stosowane są alkaliczna fosfataza lub peroksydaza chrzanowa. Wizualizacja tych enzymatycznych znaczników może być przeprowadzona kolorymetrycznie (alkaliczna fosfataza, w miejscu związania przeciwciał do białka na membranie powstaje barwny produkt) lub chemiluminescencyjnie (peroksydaza, enzym przeprowadza reakcję z wytworzeniem światła, które naświetla kliszę fotograficzną).


Detekcja białek - ECL

(ECL - ehanced chemiluminescencje), chemiluminescencja polega na wydzieleniu energii powstałej w wyniku reakcji chemicznej w postaci światła. Peroksydaza (sprzężona z przeciwciałami II-zędowymi) w obecności nadtlenku wodoru utlenia luminol, a produktem tej reakcji jest związek o niższym stanie energetycznym. Nadmiar energii uwalniany jest w postaci fotonów światła.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

217 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u