biotechnologia


 
 

Wirus zapalenia wątroby typu C

HCVWirus WZW typu C powoduje ostre i przewlekłe schorzenie, prowadzące ostatecznie do trwałego uszkodzenia wątroby, nowotworu tego narządu i śmierci pacjenta. Obecnie nie dysponujemy skuteczną szczepionką profilaktyczną przeciwko HCV, głównie z uwagi na wysoki stopień zmienności wirusa. Stosowana dotychczas terapia polega na podawaniu pacjentom PEGylowanego interferonu α w połączeniu z rybawiryną, nie jest to jednak rozwiązanie idealne. Prace nad nowymi terapeutykami opóźnia niemożność namnażania wirusa w hodowlach komórkowych. A to tylko niektóre intrygujące fakty.


Hepacivirus

Po raz pierwszy zaobserwowano go w połowie lat siedemdziesiątych ubiegłego wieku, a ponieważ różnił się właściwościami od znanych wirusów hepatotropowych nazwano go wtedy „nie-A i nie-B”. HCV jest małym otoczkowym wirusem z jednoniciowym RNA o dodatniej polarności, które koduje w jednej ramce odczytu dużą poliproteinę składającą się z 3010 aminokwasów. Poliproteina podlega obróbce przeprowadzanej przez proteazy komórkowe i wirusowe w trakcie i po translacji, wskutek czego powstają dojrzałe strukturalne i niestrukturalne białka (NS). Pośród białek niestrukturalnych, niezbędne w procesie replikacji i dojrzewania wirusa są dwa: proteaza serynowa i zależna od RNA polimeraza RNA (RdRp), stąd stanowią idealne cele drobnocząsteczkowych leków przeciwwirusowych.
Hepaciwirusy przekazywane są przez kontakt z zakażoną krwią. Od rodziny Flaviviridae, do której należą, odróżnia je niemożność hodowania w kulturach komórkowych oraz zdolność do autokatalitycznego cięcia białka prekursorowego NS2-3, co jest możliwe dzięki jego aktywności metaloproteinazy zależnej od jonów cynku. Wirus namnaża się tylko w organizmie ludzkim, a jedyny model doświadczalny stanowią szympansy.


Epidemiologia

Infekcja wirusem HCV jest poważnym problemem na skalę światową, który dotyczy 180 milionów ludzi. Szacuje się, że co roku zakaża się od 3 do 4 milionów osób. Wirus powoduje ostre i chroniczne zapalenie wątroby, które prowadzi do trwałego uszkodzenia narządu, chorób natury autoimmunologicznej, nowotworu i śmierci. Spośród wszystkich zakażonych, u około 85% rozwija się przewlekła infekcja. 70% z nich cierpi z powodu chronicznego zapalenia, a u 10-20% kończy się to marskością wątroby. Setki tysięcy ludzi umierają każdego roku z powodu niewydolności wątroby i raka tego narządu, będących następstwem zakażenia HCV.
Na podstawie zmienności sekwencji nukleotydowej izolatów z całego świata wyróżniono sześć głównych genotypów (kladów) i ponad 100 podtypów. Podobnie jak w przypadku HBV, występowanie różnych genotypów ma silne powiązanie z położeniem geograficznym. Dominuje jednak genotyp 3a, który jest przyczyną choroby 50% pacjentów z HCV na całym świecie. Klady różnią się między sobą o ok. 25-35% na poziomie sekwencji nukleotydowej. Każdy podtyp różni się od innego o 15-25%. Wiriony w organizmie indywidualnego pacjenta również są różne, a ich „niepodobieństwo” balansuje na poziomie 1-5%.
Największa zmienność dotyczy regionu hiperzmiennego glikoprotein E1 i E2. Najmniejszą zaś charakteryzuje się niekodujący region 5’ (UTR, ang. untranslated region), który zawiera drugorzędową strukturę pętli RNA i specyficzne sekwencje niezbędne do przebiegu replikacji i translacji. Zmienność jest wynikiem wysokiego poziomu replikacji oraz braku aktywności korektorskiej polimerazy RNA (RdRp). Częstość niewłaściwego dopasowania nukleotydu wynosi 10-3 substytucji w przeciągu roku.
Infekcja HCV jest procesem bardzo dynamicznym, gdyż czas życia wirusa jest wyjątkowo krótki (kilka godzin), a dziennie powstaje i jest usuwanych z krwi bilion wirionów. Wszystkie obecnie poznane genotypy wykazują hepatotropizm i właściwości patogeniczne. Badania wykazują, że genotypy różnią się infekcyjnością i patogenicznością, co wpływa na stopień postępu marskości i ryzyka kancerogenezy.


Morfologia i biologia wirusa

Wiriony wielkości około 50 nm mają sferyczny kształt i otoczone są otoczką lipidową. Rdzeń wirusa także ma kształt sferyczny. Wiriony zawierają jednoniciowy infekcyjny RNA o dodatniej polarności. Długość genomu wynosi około 9,6 kb. W obrębie końca 5’UTR znajduje się sekwencja IRES (ang. internal ribosome entry site), rejon zmiennej sekwencji (ang. sequence variable region), region polipirymidynowy i wysoko konserwowany region terminalny. W skład wirionu wchodzą tylko trzy białka: nukleokapsydowe białko C (core protein p19) oraz dwie glikoproteiny otoczki – E1 (gp31) i E2 (gp70). Białko C wiąże się z błoną retikulum endoplazmatycznego, bierze udział w wielu ważnych w cyklu życiowym wirusa procesach, takich jak transkrypcja, metabolizm lipidów i różne szlaki sygnalizacyjne. Białka E1 i E2 są wysoce glikozylowane i pełnią kluczowe funkcje w procesie internalizacji.
Sekwencje wszystkich białek strukturalnych (C, E1 i E2) zlokalizowane są na końcu aminowym poliproteiny, pośrodku znajduje się sekwencja kodująca kanał p7, a na końcu karbonylowym białka niestrukturalne. Proces replikacji jest słabo poznany, ale na pewno odbywa się przy udziale wewnątrzkomórkowego systemu błon. Genomowe RNA stanowi bezpośrednią matrycę do translacji informacji genetycznej na poliproteinę, przetwarzaną w trakcie i po zakończeniu procesu. Inicjacja translacji odbywa się w miejscu IRES w regionie 5’UTR, który zawiera także wiele blisko położonych kodonów startowych. Cięcie białek strukturalnych zachodzi z udziałem peptydaz gospodarza odcinających sekwencje sygnałowe. Wirusowe proteinazy tną zaś wszystkie połączenia białek niestrukturalnych. Składanie wirusa polega na odpączkowaniu w pęcherzykach z błon retikulum.
Białko p7, uważane za kanał jonowy (wiroporynę), znajduje się w błonie ER i ułatwia translokację NS2 do światła retikulum. Pośród białek NS, wyróżniamy m. in. białko niestrukturalne NS2 (powstałe w wyniku autokatalitycznego cięcia NS2-3), NS3 o aktywności proteinazy serynowej, helikazy i NTPazy. NS3 jako proteinaza tnie pozostałe złącza pomiędzy niestrukturalnymi białkami. NS4A jest kofaktorem niezbędnym do aktywności proteazy NS3. NS4B odpowiada za formowanie błonowego kompleksu replikacyjnego w retikulum ednoplazmatycznym. NS5A to serynowa fosfoproteina o nieznanej funkcji, istnieje w dwóch formach, zależnie od stopnia fosforylacji. I wreszcie bardzo ważne NS5B – białko o aktywności RdRp.


Cykl życiowy

Wejście wirusa jest procesem powolnym i wieloetapowym. Nie zidentyfikowano receptorów na powierzchni komórek rozpoznawanych przez wirusa, ale bardzo możliwe, że są to glikozaminoglikany (GAG), CD81, receptory zmiatacze (ang. scavenger receptors), białka z rodziny klaudyn i wiążących mannozę lektyn. Adsorpcja na powierzchni komórki może odbywać się za pomocą lipoprotein na powierzchni wirusa i GAG na błonie komórkowej. Po zainicjowaniu następuje ważny etap obejmujący interakcję glikoproteiny E2 z zewnętrzną pętlą CD81. Proces internalizacji postępuje i bierze w nim udział wiele innych, jeszcze nie do końca poznanych czynników. Organizm próbując się bronić przed wtargnięciem intruza, w zarażonej komórce produkuje białko EW-2wint, które ogranicza wejście wirusa poprzez blokowanie interakcji glikoprotein HCV i CD81.
Po internalizacji wirionu, RNA zostaje uwolnione z kapsydu i służy jako matryca zarówno do translacji, jak i replikacji. Translacja zachodzi niezależnie od obecności czapeczki na RNA, w przeciwieństwie do procesu, który wykorzystuje komórkowe mRNA. Rozpoczyna ją wiązanie regionu 5’IRES do rybosomu.
Powstawanie poliproteiny, z której wywodzą się wszystkie białka wirusowe ma miejsce w retikulum. HCV podobnie jak inne (+) ssRNA wirusy powoduje zmiany w błonie określane jako „sieć membranowa”. Polimeraza RdRp replikuje genom, syntezując nić RNA o ujemnej polarności, który służy jako matryca do produkcji nici o dodatniej polarności. Replikacja i obróbka postranslacyjna odbywają się w sieci membranowej tworzonej przez białka niestrukturalne i białka gospodarza, nazywane zbiorczo kompleksem replikacyjnym, ulokowanym w błonach sąsiadujących z jądrem komórkowym. Zanim nowe wiriony zostaną uwolnione do przestrzeni międzykomórkowej na drodze egzocytozy, w ER zachodzi enkapsulacja genomu, a cały cykl wieńczy otaczanie i dojrzewanie w aparacie Golgiego.


Strategie unikania odpowiedzi immunologicznej

Z ramienia odpowiedzi wrodzonej w procesach obrony organizmu biorą udział komórki NK, NKT, komórki Browicza-Kupffera (czyli makrofagi wątrobowe) i interferon (cytokina). W odpowiedzi nabytej uczestniczą limfocyty B wytwarzające przeciwciała oraz limfocyty T pomocnicze i cytotoksyczne. Działanie odpowiedzi immunologicznej jest dość standardowe, jak w przypadku każdej infekcji wirusowej.
Wirus próbuje umknąć uważnemu systemowi masowej obrony na różne sposoby. Przede wszystkim, blokuje w kilku miejscach szlak JAK/STAT, przekazujący sygnał pochodzący od interferonu. Białko E2 zatrzymuje kinazę białkową aktywowaną przez RNA (PKR) i funkcję białek NK. Wiele zadań spełnia też białko NS5A, zawierające region wrażliwy na interferon (ISDR). Dodatkowo, NS5A wprowadza zamieszanie w transdukcji sygnału szlaku 2-5 OAS/RNazyL i wiąże się bezpośrednio do PKR, obniżając jej poziom ekspresji. Indukuje również produkcję IL-8, hamującej przeciwwirusowe działanie interferonu. Białka otoczkowe E2 tworzą mostki krzyżowe receptora CD81, ograniczając cytotoksyczność i produkcję interferonu przez komórki NK.
Oszukiwanie odporności nabytej wymaga bardziej wyrafinowanych posunięć, mianowicie ucieczki mutacyjnej i doprowadzenia limfocytów T specyficznych względem wirusa do stanu funkcjonalnej anergii. Długotrwały proces zapalny spowodowany wzmożonym działaniem układu immunologicznego prowadzi w końcu do marskości i nowotworu wątroby. Wysoka częstość mutacji jest głównym mechanizmem pozwalającym wirusowi skutecznie imać się obrony organizmu. Jest to możliwe, dzięki brakowi aktywności korektorskiej polimerazy i wysokiemu poziomowi replikacji: dziennie u jednego pacjenta powstaje tyle wirusów, ile gwiazd mieści galaktyka Andromedy… Najbardziej zmiennym regionem jest HVR-1 w sekwencji glikoproteiny E2, który stanowi tzw. epitop neutralizacyjny – po jego związaniu przez przeciwciało wirus traci swoje właściwości infekcyjne. Pożądana w tym fragmencie zmienność wydaje się więc zrozumiała.
Wirus uszkadza także obróbkę swoich antygenów, co wpływa na nieprawidłową ich prezentację przez cząsteczki MHC i rozpoznanie – pozbawione wszystkich niezbędnych sygnałów stymulacyjnych – prowadzące do anergii limfocytów T (nie podejmują działania). Może także oddziaływać na zdolność do proliferacji komórek odpornościowych, ich aktywność cytotoksyczną i zdolność wydzielania cytokin.


Prewencja i leczenie

W przeszłości standardowym leczeniem było zastosowanie interferonu α samodzielnie lub w połączeniu z rybawiryną. Interferon stymuluje komórki do produkcji przeciwwirusowych czynników, a rybawiryna jako analog guanozynowy ingeruje w replikację wirusa. Takie połączenie pozwala utrzymać stałą odpowiedź przeciwwirusową u 30-40% chorych. Zdarza się, że infekcja samoistnie ustępuje. Istnieje duża korelacja pomiędzy spontanicznym usunięciem wirusa (genotyp 3) z krwi, a wiekiem i płcią – zjawisko częściej występuje u osób młodych i kobiet.
Z początkiem nowego milenium zaczęto stosować PEGylowany interferon (o wydłużonym czasie półtrwania) w kombinacji z rybawiryną, co daje bardzo dobre wyniki w przypadku zakażeń genotypami 2 i 3, przy 75-90% eradykacji wirusa. Zakażenie HCV stymuluje produkcję reaktywnych form tlenu, które zakłócają ścieżkę transdukcji sygnału przekazywanego przez interferon – prawdopodobnie to dlatego wielu pacjentów nie odpowiada na leczenie. Stosowanie interferonu pociąga za sobą konsekwencje w postaci dokuczliwych efektów ubocznych, jak niedobory komponentów krwi, depresja, chroniczne objawy grypopodobne. Rybawiryna także ma swoją ciemną stronę działania, niepożądanym skutkiem jej podawania jest anemia hemolityczna. Bywa, że te objawy są na tyle poważne, by przerwać leczenie.
Poziom zmienności wirusa i problemy z jego kultywacją w hodowlach komórkowych nie pozwalają na opracowanie skutecznej szczepionki. Istnieje wielka potrzeba opracowania nowych, mniej kosztownych i łagodnych terapii, które efektywnie będą działać na różne genotypy i nie przyczynią się do powstawania opornych mutantów.


Ciekawe propozycje nowoczesnych terapii

Prace nad szczepionką zmierzają głównie w kierunku tworzenia cząstek wirusowych opartych na innych wirusach wektorowych niosących białka HCV. Pośród propozycji terapii infekcji wirusowej znajduje się wiele związków hamujących aktywności białek wirusowych. Na zainteresowanie zasługują inhibitory kanału p7 – adamantany i alkilowane imino-cukry (IS) oraz amfipatyczny α-helikalny peptyd (Hp1090) z jadu skorpiona Heterometrus Petersie, który in vitro wykazuje wysoką aktywność przeciwwirusową i hamuje jego wnikanie do komórek. Adamantany hamują zaś aktywność wiroporyny, wiążąc się do miejsca kluczowego w zmianie konformacji otwierającej kanał, podczas gdy IS zapobiegają oligomeryzacji białka, interkalując pomiędzy jego protomery. Naukowcy pracujący nad nimi wierzą, że dzięki połączeniu efektów ich działania możliwe, że w przyszłości uda się położyć kres niefrasobliwej niesforności HCV.


Podsumowanie

Infekcja wirusem HCV stanowi poważny światowy problem. Obecnie, ze względu na wysoki stopień zmienności wirusa nie istnieje skuteczna szczepionka profilaktyczna, możliwości terapeutyczne są ograniczone i przynoszą niezadawalające efekty. Wirus HCV należy do grupy wymagających obiektów badawczych, gdyż nie replikuje się w hodowlach komórkowych, można żartobliwie powiedzieć, że dodatkowo jest bardzo cwany, bo potrafi umknąć wysoko wyspecjalizowanym mechanizmom obronnym. Badania pozwalające lepiej zrozumieć jego biologię ujawniły kilka możliwych celów nowych leków, w tym inhibitorów drobnocząsteczkowych. Miejmy nadzieję, że starania zespołów na całym świecie przyniosą już niebawem długo oczekiwane efekty.


Martyna Franczuk


Literatura:
1. Ashfaq U.A., Javed T., Rehman S., Nawaz Z., Riazuddin S., 2011. An overview of HCV molecular biology, replication and immune responses. Virology Journal , 8:161.
2. Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., Desselberger U, Ball L.A., 2005. Hepacivirus. Virus Taxonomy. Classification and Nomenclature of Viruses: 993-998.
3. Kato N., 2001. Molecular Virology of Hepatitis C Virus. Acta Medica Okayama, 3:133-159.
4. Purcell R.,1997. The Hepatitis C Virus: Overview. Hepatology, 3:11-14.
5. Thomson B.J., Finch R.G., 2005. Hepatitis C virus infection. Clinical Microbiology and Infection, 2: 86-94.
6. Yan R., Zhao Z., He Y., Wu L., Cai D., Hong W., Wu Y., Cao Z., Zheng C., Li W., 2011. A new natural α-helical peptide from the venom of the scorpion Heterometrus petersii kills HCV. Peptides, 32:11–19.
7. http://www.sciencedaily.com/releases/2011/06/110628112318.htm


Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

83 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u