biotechnologia


 
 

Wstępne różnicowanie aktywności metabolicznej mikroorganizmów

różnicowanie mikroorganizmów Autor: Izabela Podgórska, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, kierunek: biotechnologia


Przy wyborze aktywnych szczepów do celów biotechnologicznych można zastosować testy skriningowe już podczas izolacji kolonii czy też testując wyizolowane już wcześniej kultury [Fiedurek, 2004]. Przy braku kryteriów bezpośredniej, wstępnej oceny przydatności szczepów losowo wybrane kolonie wyrosłe na płytkach Petriego bada się w próbach fermentacyjnych. Jest to bardzo pracochłonny i mało wydajny sposób, dlatego najczęściej dąży się do opracowania szybkich testów wstępnej oceny, które umożliwiają selekcję kultur wyrosłych na podłożu agarowym, charakteryzujących się korzystnymi cechami produkcyjnymi [Chmiel, 1998]. Należy dążyć do tego, by liczba testowanych monokultur była jak największa. Dodatek do podłoża testowego odpowiednich substratów lub składników, które powodują pojawienie się barwnych stref wokół kolonii, wskazujących na występowanie danej aktywności metabolicznej, umożliwia usprawnienie badań [Fiedurek, 2004].


Tabela 1. Sposoby pozyskiwania mikroorganizmów o określonej aktywności [Bednarski, Fiedurek, 2004]

Poszukiwany metabolit Metoda testowania
Amylazy posiew na płytki agarowe ze skrobią; selekcja kolonii z jasną strefą po barwieniu roztworem jodu w jodku potasu
Antybiotyki wysiew na płytki agarowe ze szczepami testowymi; wskaźnikiem aktywności antybiotycznej są powstałe strefy zahamowania wzrostu szczepu testowego
Celulazy posiew na płytki agarowe z dodatkiem fosfocelulozy; selekcja kolonii wytwarzających przezroczyste strefy aktywności enzymu
Fosfatazy posiew na płytki agarowe z difosforanem fenoloftaleiny i wskaźnikiem pH; selekcja kolonii na podstawie zmiany barwy
Lipazy posiew na płytki agarowe z dodatkiem zemulgowanego oleju; selekcja kolonii po wytrąceniu wolnych kwasów tłuszczowych z jonami wapnia
Pektynazy posiew na płytki agarowe z pektyną; selekcja po wywołaniu roztworem cetaflonu (bromek cetylotrimetyloamonowy) kolonii, które wytwarzają jasne strefy na opalizującym tle
Proteazy Posiew na płytki agarowe z żelatyną; selekcja kolonii, które wytwarzają jasne strefy na opalizującym tle


Po dodaniu do podłoża celulozy, skrobi czy kazeiny pojawiają się jaśniejsze strefy wokół kolonii wytwarzających odpowiednio celulazy, amylazy i proteinazy. Użycie na płytkach Petriego pożywek agarowych z zastosowaniem wskaźników jakimi są błękit bromofenolowy lub czerwień obojętna, pozwala zidentyfikować kwasy organiczne lub aminy, po obserwacji zmiany barwy w określonych przedziałach pH. Testy z kwasem solnym umożliwiają wykrycie syntezy nukleaz (DN-azy, RN-azy). Powoduje on bowiem zmętnienie w miejscach zawierających niezhydrolizowany kwas nukleinowy. Test z oranżem akrydyny umożliwia obserwacje w nadfiolecie fluorescencji w miejscach z nierozłożonym podłożem. W celu identyfikacji inhibitorów enzymów stosuje się substraty, które w wyniku reakcji zmieniają barwę lub odczyn środowiska. Kolejną możliwością testowania kultur wytwarzających aminokwasy, witaminy czy antybiotyki jest tzw. metoda krążków agarowych. Z podłoża agarowego na hodowli płytkowej wycina się sterylne krążki z testowanymi koloniami. Dalej krążki te umieszcza się na płytkach z drobnoustrojem testowym, inkubuje się, a następnie mierzy strefy wzrostu kolonii wytwarzających aminokwasy czy witaminy lub ich brak, gdy wytwarzają antybiotyki. W celu uniknięcia błędu w pomiarze wielkości stref można obliczyć wskaźnik aktywności, który jest stosunkiem średnicy strefy do średnicy kolonii. Dokładniejszą metodą badania populacji jest elucja z pożywki okalającej kolonię wydzielanych metabolitów, a następnie analiza chromatograficzna, która oceni produkty pod względem ilościowym i jakościowym. Enzymy hydrolityczne można wykrywać przy pomocy testów płytkowych, polegających na wprowadzeniu odpowiedniego substratu do zbuforowanego roztworu agaru, a następnie wylaniu go na płytki Petriego. Po zastygnięciu agaru wycina się "studzienki", które wypełnia się testowanym roztworem enzymu lub badanym przesączem pohodowlanym. Po inkubacji i wybarwieniu określa się wielkość stref dyfuzji pozakomórkowych produktów metabolizmu [Fiedurek, 2004].

Metodę podwójnej hodowli na płytkach Petriego stosuje się w celu wykrycia drobnoustrojów wytwarzających antybiotyki, aminokwasy i witaminy, w której testowane kolonie wyrosłe na jednym podlożu zalewa się warstwą drugiego, z odpowiednio dobranym organizmem testowym. Wytworzenie badanego metabolitu uwidacznia się strefami wzrostu wokół badanych kolonii. W celu wykrycia szczepów nadprodukujących aminokwasy czy witaminy stosuje się metodę auksonografii, w której drobnoustroje testowe to mutanty auksotroficzne, wysiane na podłoże minimalne. Wytwarzanie i pozakomórkowe wydzielanie badanego metabolitu przez drobnoustroje nadprodukujące ujawnia się poprzez strefy wzrostu mutantów wokół badanych kolonii.

Klasyczna metoda podwójnej hodowli nie przydaje się do selekcji szczepów, które gromadzą wewnątrzkomórkowo wytwarzane produkty. Dodatkowo problemem jest izolacja czystych kultur, którym przeważnie towarzyszą komórki szczepu testowego. Opracowano szereg modyfikacji tej metody, np. oddzielenie podłoża z organizmem testowym od kolonii testowanych cienką folią celofanową, zastosowanie dwustronnych płytek z półprzepuszczalną membraną dla cząsteczek metabolitu (Rys. 3) [Chmiel, 1998].

Dokładniejszą formą skriningu drobnoustrojów jest ustalenie aktywności poszczególnych monokultur w warunkach hodowli wgłębnej, na wytrząsarkach z zastosowaniem kolb stożkowych o pojemności 100-500 ml. Zaletą jest tu duża dokładność oraz możliwość wstępnego doboru podłoża.

Możliwość zwiększenia czułości metod wstępnego różnicowania aktywności metabolicznej drobnoustrojów polega na stopniowym zmniejszaniu grubości warstwy podłoża testowego, zmianie stężenia substratu, wartości pH, temperatury reakcji itp. [Fiedurek, 2004].




Rys 1. Metody selekcji szczepów produkujących substancje biologicznie czynne [Chmiel, 1998]


Bibliografia:
1. Chmiel A.: Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa 1998.
2. Fiedurek J.: Podstawy wybranych procesów biotechnologicznych, Wyd. UMCS, Lublin 2004.
3. Bednarski W., Fiedurek J.: Podstawy biotechnologii przemysłowej, Wyd. Naukowo- Techniczne, Warszawa 2004.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

63 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u