biotechnologia


 
 

Wybrane metody modyfikacji genetycznych

Autor: Dominika Mielniczuk

Dzięki metodom mutagenezy ukierunkowanej możliwe stało się wprowadzanie zmian m.in.: mutacji punktowych, insercji oraz delecji całych odcinków DNA w określonym miejscu w genomie. Metody te polegają m.in. na wykorzystaniu miejscowo-specyficznych nukleaz, które umożliwiają wprowadzenie konkretnej zmiany. Do miejscowo-specyficznych nukleaz zaliczamy: meganukleazy, nukleazy z motywem palca cynkowego, nukleazy TALE oraz bakteryjny system CRISPR/Cas9 (Sega i Linkiewicz, 2014).


Meganukleazy

Meganukleazy zostały opisane po raz pierwszy u drożdży w latach osiemdziesiątych ubiegłego wieku. Obecność tych wysoce specyficznych endonukleaz wykazano u wielu organizmów żywych takich jak: archebakterie, fagi, grzyby, rośliny wyższe czy zwierzęta, gdzie ulegają ekspresji w jądrze komórkowym, mitochondrium i chloroplastach. Rola meganukleaz nie została jeszcze jednoznacznie określona (Sega i Linkiewicz, 2014). Enzymy te wykorzystywane są w procesach dotyczących edycji genomu (ang. genome editing). Meganukleazy katalizują powstawanie pęknięć w helisie DNA w określonym miejscu. Możliwość modyfikacji genu z użyciem samonaprowadzających endonukleaz (ang. homing endonucleases) w komórkach ssaczych wykazano po raz pierwszy w latach 90 ubiegłego wieku. Przedimek ,,mega’’ enzymy te otrzymały ze względu na umiejętność rozpoznawania długich sekwencji w DNA~ 14-40 pz (Czarnek i Breta, 2016). Biorąc pod uwagę sekwencję aminokwasową oraz strukturę powtórzeń wyróżniamy meganukleazy:
• LAGLIDADG (największa oraz najlepiej poznana),
• GIY-YIG,
• HNH,
• His-Cys,
• PD-(DIE) XK .

Enzymy te określa się również jako pasożytnicze molekuły, które posiadają zdolność samowycinania z cząsteczki gospodarza (np. Mrna z intronów) oraz przyłączania do końca innej cząsteczki. Do zalet użycia meganukleaz w inżynierii genetycznej możemy zaliczyć niewielką cytotoksyczność oraz możliwość prostego transferu do komórki. Niestety korzystanie z nich łączy się ze skomplikowaną metodyką oraz czasochłonnym procesem tworzenia konstruktów (Sega i Linkiewicz, 2014).


Nukleazy z motywem palca cynkowego

Do najczęściej użytkowanych oraz najlepiej opisanych enzymów służących do uzyskania miejscowo-specyficznej mutagenezy należą nukleazy z motywem palca cynkowego (ang. Zinc-Finger Nucleases, ZFN). W odróżnieniu do meganukleaz są to białka fuzyjne, które powstały z połączenia domeny wiążącej DNA z motywem palca cynkowego oraz domeny nacinającej DNA połączonej z enzymem FokI, który należy do enzymów typu IIS restryktaz (Sega i Linkiewicz, 2014). Enzym FokI udało się uzyskać z bakterii Flavobacterium okeanokoites, do pełnej aktywności wymaga on dimeryzacji. Cząsteczki określane palcami cynkowymi odkryte zostały podczas badań przeprowadzanych na żabie z rodzaju Xenopus obejmujących badanie struktury czynnika transkrypcyjnego III oocytów (Kowalczyk, 2016). Pojedynczy palec cynkowy składa się z ok. 30 reszt aminokwasowych, zawierających po jednej parze reszt cysteinowych i histydynowych (Gaj i in., 2013; Kowalczyk, 2016). Na strukturę drugorzędową składają się dwie beta-harmonijki oraz jedna alfa-helisa (Gaj i in., 2013). Reszty cysteinowe oraz histydynowe wiążą w centrum katalitycznym jon cynku (Zn2+), który pełni kluczową rolę w funkcjonowaniu oraz stabilności domeny (Gaj in., 2013; Kowalczyk, 2016). Pojedyncze palce cynkowe są odpowiedzialne za rozpoznawanie trzech sąsiadujących ze sobą nukleotydów. W związku z tym , że wykazują one funkcjonalność jako monomery, możliwe jest łączenie kilku palców cynkowych, w zależności od sekwencji nukleotydowych. Łączenie ze sobą od 3 do 4 monomerów daje możliwość rozpoznania miejsca wiązania DNA o długości 18-30 pz (Sega i Linkiewicz, 2014). ZFN stanowi jeden z najbardziej powszechnych motywów wiążących DNA u Eukariota oraz drugą co do wielkości, najczęściej kodowaną domenę białka w ludzkim genomie (Gaj i in., 2013). Ze względu na konieczność tworzenia osobnej pary białek dla każdej z targetowanych sekwencji , stworzenie białek służących do rozpoznawania konkretnej sekwencji jest trudne, kosztowne i bardzo czasochłonne (Czarnek i Breta, 2016).


Nukleazy TALE

Nukleazy TALE (ang. transcription activator–like effectors) po raz pierwszy zostały opisane jako białka bakteryjne. Umieszczane są w zainfekowanych komórkach roślinnych, poprzez szlak sekrecji typu III przez patogeny z rodzaju Xanthomonas (Mussolino i Cathomen, 2012), które przyczyniają się do rozwoju chorób wielu roślin (Bogdanove i in., 2010). Nukleazy, które powstały na skutek dodania do domeny wiążącej DNA, domeny nukleolitycznej (TALEN), podobnie do ZFN, zbudowane są w formie dimerów. Jednak w odróżnieniu od ZFN można je łatwiej modyfikować, co spowodowane jest prostszą budową elementów odpowiedzialnych za wiązanie DNA (Sega i Linkiewicz, 2014). W skład nukleaz TALE wchodzi: sekwencja odpowiadająca za sekrecję typu III, sekwencja odpowiadająca za translokację sygnałów w regionie N-końcowym, sygnał lokalizacji jądrowej, kwasowa domena aktywacji transkrypcji na C-końcu oraz centralna domena wiążąca DNA. Domena wiążąca DNA w zależności od tego z ilu modułów się składa (od 13 do 30) może posiadać różną długość. Jeden moduł odpowiada za wiązanie konkretnego nukleotydu. Specyficzność wiązania DNA jest wynikiem występowania polimorfizmu pomiędzy 12 a 13 resztą aminokwasową w module. Polimorficzne składowe białka TALE nazywa się odrębnymi, powtarzalnymi zmiennymi (ang. Repeat-Variable Diresidue, RVD) (Mussolino i Cathomen, 2012 ; Sega i Linkiewicz 2014). W procesach projektowania nukleaz najczęściej wykorzystywane są cztery moduły RVD:

• HD – rozpoznający cytozynę,
• NG – rozpoznający tyminę,
• NI – rozpoznający adeninę,
• NN – rozpoznający guaninę i adeninę (Sega i Linkiewicz, 2014).

Badania wykazały, że większość znanych w genomach eukariontów miejsc wiązania TALE poprzedza tymina (Kowalczyk, 2016).

Analiza struktury krystalicznej cząsteczki pozwoliła określić w jaki sposób TALE łączy się z DNA. Mechanizm działania nukleazy TALE otrzymano poprzez połączenie domeny FN należącej do enzymu FokI z białkami TALE. Podczas cięcia dochodzi do zmiany domeny, która wiąże DNA. W odróżnieniu od innych nukleaz u TALENs nie występują niepożądane oddziaływania pomiędzy składowymi. Znajomość cech charakterystycznych dla nukleazy TALE powoduje, że można określić, która domena zostanie związana oraz tak zaprojektować szereg białek, aby wiązały one pożądane miejsce (Kowalczyk, 2016).


Literatura:
1. BOGDANOVE A., SCHORNACK J., LAHAYE T., 2010. TAL effectors: finding plant genes for disease and defense. Current Opinion in Plant Biology, 13 (4), 394-401.
2. CZARNEK M., BERETA J., 2016. System CRISPR-Cas - od odporności bakterii do inżynierii genomowej. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej, 70, 901-916.
3. GAJ T., GERSBACH C.A, BARBAS C.F, 2013. ZFN, Talen and CRISPR/Cas- based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology, 31 (7), 397-405.
4. KOWALCZYK I., 2016. Molekularne narzędzia do edycji genomów wykorzystujące endonukleazy: ZFNs, TALENs i CRISPR/Cas9- porównanie. Przegląd wybranych prac z zakresu enzymologii. Fundacja na rzecz promocji nauki i rozwoju TYGIEL. ISBN: 978-83-65272-34-8
5. MUSSOLINO C., CATHOMEN T., 2012. TALE nucleases: tailored genome engineering made easy. Current Opinion in Biotechnology, 23 (5), 644-650.
6. SEGA P., LINKIEWICZ A., 2014. Wykorzystanie miejscowo-specyficznych nukleaz do modyfikacji genomów roślinnych. Postępy biologii komórki, 41 (4), 701-720.


Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

279 anonymous users oraz 0 registered users online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u