biotechnologia


 
 

Zastosowanie cytometrii przepływowej do immunofenotypowania, określenia stadium apoptozy oraz cyklu komórkowego- cytometria w nowoczesnej odsłonie NovoCyte System i NovoExpress Software



Cytometria przepływowa umożliwia ilościową i jakościową ocenę właściwości fizycznych i biologicznych komórek zarówno zwierzęcych, roślinnych jak również bakteryjnych. Cytometria od dekad jest uznana techniką badawczą i diagnostyczną opierajacą się na pomiarze intensywności zabarwienia i intensywności fluorescencji przepływającej zawiesiny odpowiednio znakowanych komórek, bądź podjednostek wchodzących w skład komórki. W artykule przedstawiliśmy trzy podstawowe zastosowania cytometrii przepływowej tj. immunofenotypowanie oraz analizę stanów apoptotycznych w oparciu o nowy, innowacyjny, podbijający amerykański rynek cytometr przepływowy NovoCyte System, certyfikowany jako instrumeny nadający się do również wykorzystania w laboratoriach diagnostycznych (IVD). Urządzenie dzięki kompaktowości, wyświetlanym uwagom dot. m.in. konieczności opróżnienia bądź uzupełnienia płynów systemowych, zautomatyzowaniu funkcji oczyszczania układu mikroprzepływowego zarówno przed jak również po pracy (sprowadzonej do naciśniecia jednego przycisku na panelu głównym urzadzenia) oraz niezwykle intuicyjnemu software’owi, otwiera drzwi przed nowymi użytkownikami, którzy do tej pory nie mieli styczności z cytometrią przepływową.


Analiza immunofenotypowa, na przykładzie leukocytów ludzkich przy użyciu 13-kolorowego panelu przeciwciał

Identyfikacja i analiza sub-populacji specyficznych komórek w zakresie immunofenotypowania jest jednym z wielu zasadniczych zastosowań cytometrii przepływowej, zwłaszcza pod względem możliwości multipleksowania i identyfikowania kilku markerów w jednej próbce.

Zastosowanie wielu markerów jednocześnie czyni immunofenotypowanie bardziej wydajnym, jednakże wiążę się to z koniecznością posiadania cytometru przepływowego wyposażonego w kilka laserów, dzięki którym użytkowanik otrzymuje zdolność do wykrywania i analizowania kilkunastu kolorów w trakcie trwania jednego eksperymentu.

Sprzęt wyposażony w trzy lasery dzięki wykorzystaniu pompy infuzyjnej z fukcją płukania pozwala na zliczanie obiektów i bezwzględny pomiar objętościowy co oznacza wynik w postaci tzw. volumetric absolute counting. W prezentowanym badaniu w oparciu o oprogramowanie NovoExpress analizowano podzbiory limfocytów T, limfocytów B i komórki zaliczane do grupy leukocytów w oparciu o 13 kolorowy panel przeciwciał. Dane wskazują, że cytometr umożliwił uzyskanie danych w wysokim 7 logarytmicznym zakresie dynamiki.




Rys.1. Immunofenotypowanie limfocytów typu T i B. A) Limfocyty, zidentyfikowane na podstawie profilu barwienia CD45+, rozdzielone na podzespoły. B.) Limfocyty T CD3+ lub limfocyty B CD19+. C.) Podzespoły limfocytów B sklasyfikowanych wg barwienia IgD i CD27. E.) Limfocyty T sklasyfikowane w oparciu o CD4+ lub CD8+ T a następnie wg sub-klasyfikacji w oparciu o barwienie (D i F) CD62L i CD45RO. G) tzw. regulatory cells (Tregs) wyróżnione w oparciu o CD25 I CD127 w populacji limfocytów T CD4+.

Eksperyment przeprowadzono w oparciu o tzw. krew ludzką pełną barwioną koktajlem przeciwciał opisanym powyżej przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. W celu usunięcia czerwonych krwinek, wykorzystano łagodne wirowanie z dodatkiem 2 ml 1X buforu do lizy RBC (ACEA Biosciences) i inkubowano przez 15 minut. Następnie próbki utrwalono w 1% paraformaldehydzie i przeprowadzono eksperyment na cytometrze przepływowym NovoCyte. Kompensacja koloru została obliczona automatycznie przy użyciu funkcji automatycznej kompensacji po uzyskaniu prób paskowych kompensacji dla pojedynczego koloru. Dla zapewnienia dokładnego bramkowania zastosowano fluorescencję FMO z ang. Fluorescence minus one.


Laser FL channel on NovoCyte Format Specificity
405nm VL1 BV421 CD25
VL2 BV510 CD3
VL3 BV570 CD14
VL4 BV605 IgD
VL5 BV650 CD62L
VL6 BV785 CD45RO
488nm BL1 FITC CD4
BL2 PE CD27
BL3 PE/Dazzle 594 CD19
BL4 Per CP CD8
BL5 PE-Cy7 CD16
640nm RL1 APC CD127
RL2 APC-Cy7 CD45
Tabela 1. Panel przeciwciał dla 13 kolorów

Rys 2. Immunofenotypowanie limfocytów i jednostek nielimfocytycznych. A.) Neutrofile i komórki NK wyselekcjonowano poprzez analizę leukocytów (CD45+) wyłączając limfocyty T oraz B w barwieniu CD16+/CA-ő. Monocyty zostały rozpoznane poprzez analizę tej samej populacji ale wykorzystując znakowanie jedynie CD14+ lub podwójnie pozytywne CD14+/CD16+. B.) Wytypowane populacje z bramkowania w punkcie A zostały wstecznie bramkowanie w oparciu o CD45 vs SSC

Analiza zjawiska apoptozy przy użyciu cytometru przepływowego

Apoptoza zwana również zaprogramowaną śmiercią komórek jest aktywnym procesem, w wyniku którego komórki regulują sposób ich umierania poprzez uruchamianie określonych szlaków, które powodują, że komórka kurczy się, kondensuje i ostatecznie oczyszcza przez fagocytozę. Jest to przeciwieństwo śmierci nekrotycznej, podczas której komórki umierają niekontrolowanie ze względu na czynniki zewnętrzne rozpadając się, co prowadzi do szkodliwych efektów, takich jak aktywacja odpowiedzi immunologicznej. Dlatego komórki apoptyczne, które umierają w bardzo uporządkowany sposób, nie powodują lub wywołują ograniczone zakłócenia w pobliżu sąsiadujących komórek i tkanek.

Apoptoza jest procesem czasowym i wielofazowym, który może być analizowany w różnych etapach w zależności od kontekstu i koncepcji badawczej. W fazie wczesnej apoptozy mitochondrium traci potencjał membranowy i nie może prawidłowo funkcjonować prowadząc do uwolnienia cytochromu c i aktywacji kaspaz. Innym wydarzeniem we wczesnym stadium apoptozy jest translokacja fosfatydyloseryny (PS) z wewnętrznej błony komórkowej do przestrzeni zewnętrznej. W późniejszych etapach apoptozy błony komórkowe stają się przepuszczalne, pogarszając ich integralność i selektywny transport związków chemicznych przez błonę.

W celu wykazania wszechstronności i wielofunkcyjności system NovoCyte do oceny zdarzeń apoptotycznych, poniżej przedstawiono testy, które umożliwiają pomiar apoptozy w odpowiedzi na staurosporynę. Obecnie wyróżnia się apoptozę zależna i niezależną od kaspaz. Staurosporyna, w różnych typach komórek indukuje oba rodzaje apoptozy. W pierwszym teście wykorzystano aneksynę V, w celu związania odsłoniętego PS na błonach komórkowych do znakowania wczesnych komórek apoptycznych i barwnika wiążącego DNA 7-AAD do znakowania późnych komórek apoptycznych. Test wykazuje, że staurosporyna indukuje apoptozę zarówno w komórkach Jurkat T, jak i komórkach HeLa. Na rysunku 2 za pomocą intuicyjnego oprogramowania NovoExpress szybko wyróżniono komórki we wczesnym i późnym stadium apoptozy.

Drugi test wykorzystuje barwnik fluorescencyjny JC-1, mierzący utratę potencjału błonowego mitochondriów we wczesnych komórkach apoptotycznych. Barwienie związkiem JC-1 wiąże się ze zmianą koloru z pomarańczowego na zielony, co świadczy o spadającym potencjale na błonie mitochondriów. Gdy utrzymuje się prawidłowy potencjał membrany, J-C1 emituje fluorescencję w kanale PE. Jeśli jednak potencjał membrany zostanie utracony, JC-1 zostaje uwolniony z przestrzeni mitochondrialnej i trafia do cytoplazmy w postaci monomerycznej, emitując fluorescencję w kanale FITC. Tak więc, stosunek PE do FITC może reprezentować zmiany w potencjale membrany mitochondriów.

Jak pokazano na rysunku 2, w porównaniu z próbkami stanowiącymi kontrolę, komórki Jurkat T traktowane staurosporyną mają mniejszy potencjał błony mitochondrialnej, który w sposób ciągły maleje w czasie do 6 godzin. Taka odpowiedź jest podobna do tej obserwowanej na komórkach traktowanych znanym czynnikiem depolaryzującym błonę mitochondrialną, FCCP. Trzeci test określa ilościową aktywność kaspazy. Do komórek dodaje się cząsteczki powodujące specyficzne cięcie dla kaspazy.

W wyniku rozszczepienia tych aktywowanych kaspaz we wczesnych komórkach apoptycznych, cząsteczki “sondy” wchodzą do jądra, wiążą się z DNA i emitują fluorescencję. Umożliwia to bezpośrednie odczytywanie aktywowanych kaspaz w komórkach. Jak pokazano na rysunku 3, limfocyty Jurkat T traktowane staurosporyną wykazują większą aktywność kaspazy niż te, komórki kontrolne. Opisane tu trzy testy przedstawiają ilościowe, powtarzalne testy do pomiaru populacji komórek, które ulegają apoptozie na różnych etapach. Wskazane testy apoptotyczne są łatwe do przeprowadzenia na cytometrze NovoCyte biorąc pod uwagę możliwość wykorzystania przez użytkownika funkcji automatycznej kompensacji i szerokiego zakresu dynamicznego wykrywania fluorescencji, eliminując tym samym skomplikowaną nawet dla zaawansowanych użytkowników, konieczność regulacji napięcia (PMT).




Rys.3. Wykrywanie wczesnej apoptozy przy użyciu aneksyny V/7-AAD w komórkach traktowanych staurosporyną. Komórki T Jurkat poddano A.) kontroli nośnika lub B) traktowano 2uM staurosporyną a C.) komórki HeLa traktowano 2 uM staurosporyną przez 4 godziny. Po tym czasie komórki analizowano pod kątem wczesnej i późnej apoptozy poprzez barwienie fosfatydyloseryną z aneksyną V-FITC i barwnikiem wiążacym DNA tj. 7-AAD (BioLegend), a następnie analizowano na cytometrze NovoCyte.



Rys. 4 Staurosporyna stanowi modulator potencjału membrany mitochondrialnej w komórkach T Jurkat. Komórki T Jurkat podzielono na A.) grupę kontrolną otrzymującą jedynie nośnik, B) traktowane 2uM staurosporyną przez 6 godzin lub C.) związkiem FCCP. Do pomiaru przepływu cytometrycznego potencjału błony mitochondrialnej komórek wykorzystano barwnik JC-1 (Life Technologies). W zdrowych komórkach barwnik jest lokalizowany w mitochondriach i tworzy agregaty emitujące fluorescencję w kanale PE. W komórkach, w których potencjał membrany mitochondrialnej został zakłócony, barwnik uwalniany jest do cytoplazmu w postaci monomery, emitującego fluorescencję wykrywalną w kanale FITC. Wpływ związku na badane komórki można ocenić na podstawie stosunku fluorescencji w kanale PE do fluorescencji w kanale FITC. D.) Wykres słupkowy reprezentuje stosunek komórek Jurkat T w różnych punktach czasowych po traktowaniu staurosporyną. Wszystkie traktowane komórki (w tym kontrola pozytywna dla FCCP) wykazywały niższy stosunek w odniesieniu do kontroli.



Rys. 5 Wykrywanie aktywności kaspazy 3/7 w komórkach T Jurkat traktowanych staurosporyną. Komórki T Jurkat poddano działaniu 2uM staurosporyny po A) 0h lub B) 4 godzinach i znakowano barwnikiem wiążącym fluorescencyjny kwas nukleinowy sprzężony z DEVD (Life Technologies) i barwnikiem 7-AAD (BioLegend). Komórki kontrolne wykazują minimalną aktywność kaspazy. Po 4 godzinach od podania staurosporyny komórki wykazują zwiększenie aktywności kaspazy 3/7 (99,7%).



Więcej informacji dostępnych pod adresem.

Literatura:
  1. Maecker TH, McCoy JP, and Nussenblatt R. Immunol. 2012 Feb 17; 12(3): 191–200.
  2. Kepp O, et al. Cell death assays for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2011 Mar; 10(3):221-37 2.
  3. Susan Elmore. Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death. Toxicol Pathol. 2007; 35(4): 495-516

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

335 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u