biotechnologia


 
 

Zastosowanie linii komórkowych Caco-2 do oceny biodostępności składników pokarmowych

Autor: Paulina Kęska

W literaturze przedmiotu biodostępność jest definiowana jako szybkość i zakres, w jakim dany składnik spożywanego pokarmu jest absorbowany z przewodu pokarmowego do miejsca działania. Inaczej mówiąc, składnik pożywienia powinien zachować swoje właściwości podczas wchłaniania w przewodzie pokarmowych wprost do układu krwionośnego i dotrzeć do miejsca jego działania, tj. konkretnych tkanek lub narządów (rysunek 1).



Rysunek 1. Procesy, jakim poddawane są składniki pokarmowe, istotne z punktu widzenia oceny ich biodostępności – opracowanie własne na podstawie Grajek i in. [2]

Biodostępność jest głównym wyróżnikiem w ocenie efektywności działania środków żywnościowych lub farmakologicznych. Istnieje wiele metod, zarówno in vivo jak i in vitro, stosowanych dla określenia stopnia trawienia i wchłaniana. Analizy in vivo (w organizmie) uważane są za bardziej wiarygodne, gdyż uwzględniają naturalne warunki środowiska przewodu pokarmowego. Ocena biodostępności in vivo opiera się przede wszystkim na ilościowej ocenie markerów w moczu, krwi czy kale, jednak analizy te są czasochłonne i trudne ze względu na bardzo niski stężenie analitu. Z tych powodów opracowano wiele modeli in vitro symulujących warunki przewodu pokarmowego. Przeprowadzenie badań in vivo nad biodostępnością poszczególnych składników jest niezwykle trudne, głównie ze względu na brak możliwości bezpośredniego monitorowania wnętrza przewodu pokarmowego i możliwości oceny interakcji z innymi składnikami pokarmowymi w jego wnętrzu. Także nieinwazyjne pobieranie próbek do analiz z wnętrza organizmów żywych budzi wiele wątpliwości na tle religijnym lub etycznym.


Jednym z rozwiązań stosowanych do badań in vitro biodostępności składników pokarmowych lub farmaceutycznych są kultury komórkowe. Modele oparte na hodowli komórkowej zostały po raz pierwszy opisano w 1990 do testowania leków [3]. Od tamtej pory są wykorzystywane do oceny mechanizmów wchłaniania czy określenia minimalnego stężenia toksyczne, alergizujące. Hodowle komórkowe ludzkich enterocytów in vitro prowadzone w wyspecjalizowanych laboratoriach badawczych umożliwiają zastosowanie linii komórkowych jako modeli w badaniach nad transportem transbłonkowym. Stały się one podstawowym narzędziem wykorzystywanym do oceny ich biodostępności [2,5,6].


Najczęściej stosowaną linią komórkową jest Caco-2. Są to komórki pochodzące z ludzkiego gruczolaka okrężnicy (jelito grube), cechujące się wzrostem adherentnym (tworzą trwałe połączenia z podłożem). Komórki Caco-2 wykazuje wiele morfologicznych i biochemicznych podobieństw do komórek jelita - enterocytów. Cechą wyróżniającą komórki Caco-2 od innych linii komórkowych jest zdolność do tworzenia rąbka szczoteczkowego, czyli systemu mikrokosmków na powierzchni komórki. Ponadto, komórki te wytwarzają ścisłe połączenia między sobą (podobnie jak enterocyty), ponadto mają zdolność do produkcji enzymów (np. alkalicznej fosfatazy, sacharazy i aminopeptydazy) oraz systemów transportujących substancje ze światła przewodu pokarmowego wprost do krwioobiegu. Dzięki temu wykazują funkcjonalne podobieństwo do nabłonka jelita cienkiego, imitując naturalne warunki in vivo przewodu pokarmowego . Specyficzne właściwości komórek Caco-2 wynikają ze zdolności do różnicowania się komórek złośliwych nowotworów w komórki zbliżone morfologicznie i fizjologicznie do prawidłowych komórek jelita (enterocytów) pod wpływem czynników indukujących [2,5,6,7] .



Rysunek 2. Schemat naczynka hodowlanego z monowarstwą enterocytów – opracowanie własne na podstawie Stasiak i Sznitowska [6]

W badaniach nad transportem transnabłonkowym stosuje się specjalne naczynia hodowlane zbudowane w formie zamkniętego, dwukomorowego pojemnika, w którym kultura komórek nabłonkowych rozwija się na porowatej membranie umieszczonej między górną (apikalną) a dolną (podstawna, bazolateralną) komorą (rysunek 2). Komory wypełnione są pożywka hodowlaną, umożliwiającą namnażanie się komórek. Po okresie adaptacji warstwy komórek na filtrze (membranie), następuje ich wzrost oraz konfluencja (miara liczby komórek wyrażona jako procent powierzchni naczynia hodowlanego zajętego przez komórki). Proces ten monitoruje się za pomocą pomiarów wartości oporu elektrycznego (Transepithelial Electrical Resistance, TEER) pomiędzy komorami. Gdy komórki znajdują się fazie stacjonarnej, osiągają wysokie i niezmienne wartości TEER. Cały proces trwa około 2-3 tygodni, po którym otrzymuje się monowarstwę wysoko spolaryzowanych komórek, o budowie typowej dla enterocytów, z rąbkiem szczoteczkowym w części szczytowej [2]. Na tym etapie można przejść do rozpoczęcia eksperymentu. Właściwe badanie transportu polega na umieszczeniu badanego roztworu (zawierającego składnik pokarmowy) w górnej komorze, zaś dolna komora jest wypełniona roztworem akceptora, z którego pobiera się próbki płynu, a następnie mierzy się ilość substancji odżywczych lub biologicznie czynnego w celu określenia wydajności absorpcji [1,6,7]


Mimo niewątpliwych zalet linii komórkowych Caco-2, nie są one pozbawione wad. Jako najważniejsze należy wymienić [2]:

  • zachodzi w nich w głównej mierze transport pasywny, zaś przy badaniu transportu aktywnego wyniki znacznie odbiegają od rezultatów uzyskanych w badaniach in vivo,
  • Caco-2 odznacza się znacznie większym zagęszczeniem w porównaniu z nabłonkiem in vivo przewodu pokarmowego, co wpływa na przepuszczalność monowarstwy,
  • niepełny metabolizm w porównaniu z enterocytami in vivo (np. słabsza ekspresja cytochromu P450).
  • Mimo wymienionych niedogodności, trawienie in vitro w modelu hodowli komórkowej Caco-2 oferuje szybką i tanią metodę badań nad biodostępnością składników pokarmowych, zanim jeszcze zostaną potwierdzone na organizmach ludzkich in vivo. Jak donoszą Mahler i in. [4], ocena biodostępności żelaza w modelu trawienia in vitro oparta na hodowli komórek Caco-2 jest dobrze skorelowana jakościowo z wynikami badań na ludziach. Zatem model trawienia in vitro wykorzystujący linie komórkowe Caco-2 jest dobrym narzędziem eksperymentalnym, pomocnym w dokładniejszej ocenie biodostępności spożytych substancji.


    Literatura:
    1. Fernández-García, E., Carvajal-Lérida, I., & Pérez-Gálvez, A. (2009). In vitro bioaccessibility assessment as a prediction tool of nutritional efficiency. Nutrition Research, 29(11), 751-760.
    2. Grajek, W., Olejnik, A., & Stanaszek, K. (2006). Kultury komórkowe nabłonka jelitowego jako model do badania transportu trans nabłonkowego. Biotechnologia, 2(73), 148-165.
    3. Karlsson, J., & Artursson, P. (1991). A method for the determination of cellular permeability coefficients and aqueous boundary layer thickness in monolayers of intestinal epithelial (Caco-2) cells grown in permeable filter chambers. International journal of pharmaceutics, 71(1-2), 55-64
    4. Mahler, G. J., Shuler, M. L., & Glahn, R. P. (2009). Characterization of Caco-2 and HT29-MTX cocultures in an in vitro digestion/cell culture model used to predict iron bioavailability. The Journal of nutritional biochemistry, 20(7), 494-502.
    5. Neumann, M., Goderska, K., Grajek, K., & Grajek, W. (2006). Modele przewodu pokarmowego in vitro do badan nad biodostępnością składników odżywczych. Żywność Nauka Technologia Jakość, 13(1), 30-45.
    6. Stasiak, P., & Sznitowska, M. (2010). Zastosowanie hodowli komórkowych w badaniach biofarmaceutycznych. Farm Pol, 66(3), 228-234.
    7. Tarko, T., Duda-Chodak, A., & Zając, N. (2013). Digestion and absorption of phenolic compounds assessed by in vitro simulation methods. A review. Roczniki Państwowego Zakładu Higieny, 64(2)

    Komentarze

    Widok Uszereguj
    Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

    Podręcznik biotechnologii

    Kto jest online

    60 gości oraz 0 użytkowników online.

    Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


     
     
     
    Partnerzy:

    laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

    Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



    Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
    stat4u