biotechnologia


 
 

Zastowanie Limulus polyphemus w przemyśle biomedycznym

Autor: Anna Pawłowska

Skrzypłocze (Limulus) pełnią ogromna rolę w naszym życiu, choć nie zawsze zdajemy sobie z tego sprawę. Ba! nie zawsze nawet wiemy o istnieniu tych żywych skamielin, których wygląd może przyprawić o ciarki niejedną osobę. Choć istnieją w niemal niezmienionej postaci przez miliony lat, dopiero stosunkowo niedawno odkryto w nich potencjał ekonomiczny – a dokładniej ten, który mają we krwi. Dostrzeżono bowiem, że krew skrzypłoczy w obecności endotoksyn bakterii Gram-ujemnych ulega koagulacji, co zrewolucjonizowało przemysł biomedyczny [1].



Ryc. 1. Limulus polyphemus [9].


Podstawowe informacje o gatunku Limulus polyphemus


Limulus polyphemus, należy do staroraków, a zasięg jego występowania rozciąga się wzdłuż wybrzeża Ameryki Północnej, obmywanego przez Atlantyk, ale można spotkać go również na Filipinach, Sumatrze, Borneo oraz w Japonii [2][7]. Ich połów przypada na okres na przełomie wiosny oraz lata, czyli w okresie tarła. Nie są wymagane w tym celu specjalne nakłady finansowe, gdyż nie jest potrzebny żaden specjalistyczny sprzęt w postaci sieci czy drag. Największy połów skrzypłoczy ma miejsce w stanach środkowego Atlantyku [1]. Jednym z celów ich połowu jest ich wykorzystanie jako przynęty do łowienia węgorzy – co ciekawe, naukowcom udało się wyizolować substancję chemiczną tam zawartą, która jest odpowiedzialna za wabienie węgorzy, jednak do tej pory nie opracowano syntetycznej przynęty na tej podstawie, która byłaby ekonomicznie opłacalna [3].

Populację skrzypłoczy także w dużej mierze regulują ptaki zamieszkujące linię brzegową, które żerują na ich jajach. Samice Limulus polyphemus jednorazowo składają prawie 90 tys. jaj w okresie wiosenno-letnim. Pod powierzchnią piasku są bezpieczne, jednak gdy wydostaną się na powierzchnię pod wpływem działania czynników zewnętrznych, stają się łatwym łupem dla ptactwa [3].

Ciało Limulus polyphemus jest składa się z trzech części – dwudzielnego pancerza, części brzusznej oraz kolca ogonowego, który mimo groźnego wyglądu wcale nie służy do obrony, lecz do zakopywania się w piasku oraz ułatwia pływanie. Z części spodniej pancerza wyrasta siedem par odnóży, z których pierwszą parą są szczękoczułki, następnie pięć par odnóży służących do przemieszczania się oraz jedna para chilarii. Z części brzusznej wyrasta szczęść par przydatków, z których pierwszą parę stanowi operculum narządów rozrodczych, a kolejnych pięć par jest powierzchnią wymiany gazowej [2].



Ryc. 2. Limulus polyphemus spodnia strona [10].


Ciekawy jest fakt, że w przeciwieństwie do większości zwierząt, skrzypłocze pływają odnóżami do góry rytmicznie nimi poruszając, natomiast kolec ogonowy służy jako ster – pomaga w obraniu odpowiedniego kierunku oraz ułatwia przywracanie odpowiedniej pozycji ciała po opadnięciu na dno. Miarowy ruch kończyn jednak osłabia je i zwierzę opada na dno pancerzem skierowanym wciąż ku dołowi. Anatomiczna budowa ciała Limulus polyphemus uniemożliwia mu pływanie w pozycji pancerzem skierowanym ku górze [2].

W obecności drapieżników oraz podczas spadku temperatury wody skrzypłocze zakopują się w dnie zbiornika wodnego. Zagrzebywanie się także umożliwia utrzymanie w czystości pęcherza – chroni przed pasożytami. Warto również zauważyć, że okres aktywności skrzypłoczy przypada w nocy [2].


Biomedyczne zastosowanie krwi Limulus polyphemus


Limulus polyphemus nie jest jednak poławiany tylko jako przynęta, ale także ze względu na swoje zastosowanie w przemyśle biomedycznym. System immunologiczny Limulus polyphemus jest przystosowany do środowiska jego życia, w którym przebywa ogromna liczba bakterii Gram-ujemnych – zarówno w słonej morskiej wodzie, jak i na piasku plaż. Ich układ immunologiczny jest wrażliwy na endotoksyny tych bakterii, które indukują odpowiedź immunologiczną. Krwią Limulus polyphemus jest hemolimfa, która swój niebieski kolor zawdzięcza miedzi. Głównym typem komórek hemolimfy są amebocyty [3].

Endotoksyna pochodzącą z bakterii Gram-ujemnych (LPS) indukuje odpowiedź immunologiczną, która powoduje koagulację hemolimfy oraz aglutynację komórek, co objawia się w postaci skrzepu. Odkrycie tej właściwości krwi skrzypłoczy doprowadziło do masowego wykorzystywania ich w przemyśle biomedycznym jako czułego bioindykatora toksyn bakteryjnych oraz stworzenia testu LAL (ang. Limulus Amebocyte Lysate), który pozwala na wykrycie niezwykle małej ich ilości (10-15 g) w bardzo krótkim czasie [3].

Endotoksyny bakteryjne są wszechobecne oraz bardzo trudne do unieczynnienia. Są czynnikiem pirogennym, który po dostaniu się do organizmu, zwłaszcza ludzkiego - mogą wywołać gorączkę, doprowadzić do szoku endotoksycznego, a w większej ilości - nawet do zgonu. Potencjalną drogą dostania się do organizmu są wszelakie iniekcje, szczepionki oraz implanty, dlatego też wszelkie tego typu wyroby powinny być jałowe i pozbawione toksyn bakteryjnych – do ich detekcji używa się masowo testu LAL [3][7].

Krew pobiera się poprzez punkcję serca tylko z odpowiednio wyselekcjonowanych i należycie dużych zwierząt; z jednego osobnika, w zależności od wielkości zwierzęcia, można jednorazowo pobrać 200-400 ml krwi. Cały proces przebieg w warunkach sterylnych, aby zminimalizować ryzyko koagulacji. Pobieranie krwi przebiega szybko, a postępowanie nie należy do zbyt skomplikowanych – wprawiony laborant może dokonać tego w około 10 minut [6].



Ryc. 3. Proces pobierania krwi z Limulus polyphemus w laboratorium [11].


Test LAL (ang. Limulus Amebocyte Lysate Test)


Test LAL z zastosowaniem krwi skrzypłoczy (lizatu amebocytów) jest szeroko rozpowszechnioną metodą wykrywania endotoksyn w przemyśle biomedycznym, wprowadzoną jako alternatywa do testów wykorzystujących w tym celu króliki. Króliki bowiem były niedoskonałym indykatorem endotoksyn ze względu na swoją wrażliwość na inne składniki badanych substancji, które w większych ilościach mogły same wywoływać efekt pirogenny lub związki w nich zawarte mogły maskować ten efekt [4][7]. Dodatkowo test LAL jest najbardziej wrażliwym i specyficznym testem stosowanym do wykrywania endotoksyn w lekach iniekcyjnych, szczepionkach oraz innych wyrobach biomedycznych [5]. Do pomiaru stężenia endotoksyn została opracowana specjalna jednostka endotoksyczna – EU (ang. Endotoxin Units) [4][7].

Test LAL zależny jest od proteazy inicjującej krzepnięcie krwi w obecności LPS, a aktywność proteazy jest odczytywana kolorymetrycznie [6]. Kontakt krwi Limulus polyphemus z LPS doprowadza do zlepienia się amebocytów oraz do ich lizy, w wyniku czego poza komórkami powstają agregaty [7]. Podstawowym mechanizmem testu jest dwuetapowa kaskada zdarzeń, która najpierw doprowadza do przekształcenia proenzymu w enzym aktywny (koagulazę) w obecności endotoksyny oraz w drugim etapie przekształcenie koagulogenu (białka znajdującego się w lizacie amebocytów) w koagulinę poprzez działanie koagulazy powstałej w poprzednim etapie (dzięki temu zaktywowanemu enzymowi wiązania wewnątrz białka koagulogenu ulegają hydrolizie) [8].

Test LAL wykonywany jest w kilku odmianach – wyróżniamy: metodę żelową, turbidymetryczną oraz chromogenną [7].

Warto zaznaczyć, że skrzypłocze są nie tylko cenionym bioindykatorem, który zrewolucjonizował rynek biomedyczny, ale przede wszystkim ważną częścią spójnego ekosystemu jakim jest zatoka Delaware – ich jaja są jednym z podstawowych pokarmów dla ptaków zasiedlających zatokę [2] lub będącą dla nich tylko etapem podróży, na którym mogą nabrać masy ciała oraz sił, z czego kilkanaście z nich jest uznanych za zagrożone. Firmy zajmujące się pozyskiwaniem krwi ze skrzypłoczy zaznaczają, że wszystko odbywa się w sposób ściśle nadzorowany, a stawonogi po oddaniu odpowiedniej ilości krwi zostają wypuszczane do naturalnego środowiska bez szkody dla ich zdrowia. Szacuje się jednak, że śmiertelność po takim zabiegu sięga nawet 15%. [5]. Warto więc przy eksploatacji tego gatunku wziąć pod uwagę jego stale zmniejszającą się populację [3]. Do walki o zmniejszenie liczby skrzypłoczy, które są dawcami krwi przystąpiła między innymi organizacja PETA.


Literatura:
1. Botton M. L., Ropes J. W., 1987, The horseshoe crab, Limulus polyphemus, fishery and resource in the United States, Marine Fisheries Review, 49(3), 57-61
2. Vosatka E. D, 1970, Observations on the swimming, righting, and burrowing movements of young horseshoe crabs, Limulus Polyphemus, The Ohio Journal of Science, 70(5), 278-283
3. Hurto, L., 2003, Reducing post-bleeding mortality of horseshoe crabs (Limulus polyphemus) used in the biomedical industry.
4. Blechova R., Pivodova D., 2001, Limulus amoebocyte lysate (LAL) test-An alternative method for detection of bacterial endotoxins, ActaVeterinaria Brno,70(3), 291-296
5. Gisler P., Michael M., 2011, Companions at a distance: Technoscience, blood, and the horseshoe crab, Society & Animals, 19(2), 115-136
6. Armstrong P., Conrad M., 2008, Blood collection from the American horseshoe crab, Limulus Polyphemus, JoVE (Journal of Visualized Experiments), (20), 388-394
7. Aleksandrowicz J., Kudelski Z., 1997, Test LAL [LimulusAmoebocyteLysate] w zastosowaniu do oceny bezpieczeństwa biopreparatów, Roczniki Państwowego Zakładu Higieny, 3(48), 275-282
8. Noworyta J., Ząbek J., Brasse-Rumin M., Gago J., Rell-Bakalarska M., 2006, Obecność endotoksyny w płynach stawowych u pacjentów z chorobami narządu ruchu jako marker podejrzewanej etiologii infekcyjnej. Reumatologia, 44, 1
9. Ryc. 1. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Limulus_polyphemus_(aq.).jpg
10. Ryc. 2. http://horseshoe-crabs.com/horseshoe-crab-pictures/
11. Ryc. 3. http://www.pbs.org/wnet/nature/crash-a-tale-of-two-species-the-benefits-of-blue-blood/595/

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

209 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u