biotechnologia


 
 
UWAGA. Artykuł jest poniżej.

Drodzy Czytelnicy e-biotechnologia.pl. Mamy do Was ogromną prośbę!



Portal ten tworzony jest przez lubelskich naukowców i od ponad 10 lat staramy się, aby w Wasze ręce trafiały treści, które pomagają Wam w zdobywaniu wiedzy.
Dzisiaj My prosimy Was o pomoc i przysługę!
Ci sami naukowcy, którzy tworzą e-biotechnologia.pl tworzą również projekt NEXBIO.
NEXBIO rozwija technologie analizy DNA, które mają szansę obniżyć użycie pestycydów w rolnictwie. Ponadto budujemy mobilne laboratorium genetyczne, które umożliwi wykrywanie chorób roślin już na polu. Więcej o nas tutaj: Onet Rano, INN:Poland, Chivas Venture NEXBIO.

NEXBIO reprezentuje Polskę w niezwykle prestiżowym konkursie THE VENTURE rywalizując w gronie 30 innowacyjnych pomysłów z całego świata. Mamy szansę wygrać, ale nie odbędzie się to bez Waszej pomocy. Prosimy Was o głosy w konkursie. To dla nas wielka szansa! Dla nas to fundusze na rozwój projektu jakim jest mobilne laboratorium genetyczne. Jeśli nas wesprzecie, bardzo prawdopodobne jest, że za kilka lat, również będziecie z niego korzystać.

Jak można na nas zagłosować (to zajmie tylko kilka sekund!):


1. Należy wejść na stronę organizatora konkursu: Konkurs The Venture
2. Kliknąć w przycisk Zaloguj się przez Facebook aby oddać głos
3. I następnie koniecznie kliknąć w przycisk Potwierdź swój głos

Bardzo Wam dziękujemy!
ZESPÓŁ E-BIOTECHNOLOGIA.PL
 

DDRT-PCR

probówkiŻywe organizmy, w swoich genomach, posiadają dziesiątki tysięcy unikalnych genów, z których tylko niewielka frakcja, być może 15%, ulega jakiejkolwiek ekspresji. Dlatego istnieje regulacja ekspresji odpowiednich genów, która steruje rozwojem komórek, nie tylko zdrowych - również patologicznych. Podstawowym problemem jest identyfikacja tych genów. DDRT-PCR został opracowany w roku 1992 po to żeby szybko i dokładnie stwierdzić zmienioną ekspresję danego genu.
W przeciwieństwie do innych technik DDRT-PCR może bez problemu „działać” przy bardzo niewielkiej ilości RNA – jest więc bardzo czułe. Metoda ta opiera się na założeniu, że każdy mRNA ulegający ekspresji w komórce może być wykryty na żelu agarozowym po uprzedniej reakcji odwrotnej transkrypcji z udziałem odpowiednich primerów, które mają statystyczną szansę do przyłączenia się do odpowiedniej sekwencji w populacji różnych mRNA. DDRT szybko zastępuje tradycyjne metody klonowania genów ponieważ jest bardzo efektywne w identyfikacji sekwencji, które ulegają zmiennej ekspresji, oraz, co ważniejsze – rozpoznaje transkrypty interesujących nas genów w populacji mRNA – co ciekawe wystarczą mikro lub nawet nanogramy RNA żeby reakcja się powiodła.
DDRT-PCR przebiega podobnie jak RT-PCR. mRNA musi być zidentyfikowany, następnie powstałe cDNA jest ponownie odzyskiwane z żelu agarozowego, reamplifikowane i wklonowane w odpowiedni wektor plazmidowy. Ekspresja genu musi być potwierdzona niezależnymi analizami RNA takimi jak slot blot czy northern blot – zanim ustalimy sekwencje klonowanego genu. Ponieważ nici cDNA klonowane przez DDRT-PCR są generalnie dość krótkie (150-500bp) i reprezentują region 3’ genu, izolacja genów o pełnej długości z bibliotek DNA jest niezbędna przed oceną ich funkcji. Primery końca 3’używane do DDRT-PCR są tak skonstruowane, aby ulegały hybrydyzacji z poliadenylowymi ogonkami mRNA. Primery końców 5’ są krótkie, stanowią losowe sekwencje oligonukleotydów, które hybrydyzują losowo w pewnej odległości od primera 3’. Pary primerów muszą być tak dobrane żeby każda z nich doprowadzała do amplifikacji innych fragmentów cDNA o różnej masie molekularnej w celu optymalnego rozdziału na żelu (przeważnie 70-100 regionów). Reakcja RT rozpoczyna się od hybrydyzacji primera na końcu 3’ z końcem poli-A. Po utworzeniu nici cDNA, amplifikacja następuje z udziałem primerów 3’ i 5’ – żeby cDNA było amplifikowane primer końca 5’ musi zhybrydyzować z cDNA w odległości nie większej niż 2-3 kb (przecietny rozmiar mRNA wynosi 1,2kb).

Etapy:
1.Przygotowanie RNA (RNA preparation):
- efektywne zniszczenie komórek lub tkanek (dezintegracja materiału)
- inaktywacja aktywności RNAz
- denaturacja kompleksów nukleoproteinowych
- oczysczenie RNA z DNA i białek

Prostym testem na wykrycie zanieczyszczenia kwasem DNA jest wstępny PCR przeprowadzony w takich samych warunkach jak ten przeprowadzony dla DDRT tylko pomijający syntezę pierwszej nici cDNA. Jeśli na żelu agarozowym pojawią się prążki – wskazują na obecność DNA.

2.RT-PCR – reakcja odwrotnej transkrypcji i PCR
3.Izolacja DNA z żelu agarozowego (np. tylko cDNA powyżej 200bp są wycinane i odzyskiwane z żelu – selekcja taka uzyskiwana jest dzięki zastosowaniu markera – prążki widoczne są dzięki barwnikowi) – elucja dokonywana jest w wodzie destylowanej i mimo, że ilość wypłukanego cDNA jest mała – wciąż wystarczy do reamplifikacji. Często też dodawany jest glikogen w celu precypitacji małej ilości cDNA.
4.ponowna reamplifikacja uzyskanych fragmentów cDNA – konieczna jest w celu późniejszego przeprowadzenia analizy ekspresji i klonowania. Generalnie wystarczą 4 mikrolitry cDNA w obecności par tych samych primerów jakie użyte były do RT. Odpowiednie temperatury i ilość cykli są takie same jak w poprzednim PCR, ale koncentracja dNTP powinna być wyższa.
5.klonowanie interesujących nas fragmentów cDNA np. w wektor pCR-TRAP zawierający represor genu cI faga lambda, którego produkt jest inhibitorem aktywności promotora, który kontroluje ekspresje genu odporności na tetracyklinę. Insert powoduje inaktywację represora genu odporności.
6.identyfikacja wklonowanych fragmentów - po transformacji zrekombinowane plazmidy sprawdzane są na obecność insertów w wyniku trawienia odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Istnieje prosta metoda amplifikacji wklonowanych insertów wykorzystująca lizat uzyskany z pojedyńczej kolonii jako „matrycy” i sekwencji otaczających wklonowany fragment jako primerów.
7.potwierdzenie zmiennej ekspresji klonowanych fragmentów cDNA – analiza Northern Blot jest standardową procedurą używaną do potwierdzenia, że prążki cDNA wyizolowane z żelu reprezentują interesujący nas gen. Slot Blot również może być użyta, ale tylko do wstępnych analiz większej ilości „przypuszczalnie pozytywnych” cDNA - rezultaty muszą być potwierdzone na Northern Blot.
8.sekwencjonowanie – stanowi ostateczny dowód na to, że mamy do czynienia z ekspresją danego genu – sekwencję RNA otrzymuje się przez przekształcenie go w cDNA i sekwencjonowaniu metodą terminacji łańcucha.

Przykładowe zastosowanie DDRT-PCR:
Za pomocą DDRT-PCR badano ekspresję genów pszenicy zwyczajnej - genów, które ulegają ekspresji w odpowiedzi na wernalizację. Dwie izogeniczne linie Vrn-A1 (Vrn-A1 – pszenica jara, vrn-A1 – pszenica ozima) były poddane wernalizacji, poddano jej m.in. rozwijające się zarodki. Z pośród wyizolowanych 110 fragmentów cDNA o zmiennej ekspresji, 48 sprawdzono pod względem ich lokalizacji w chromosomach i oznaczono jako wec (wheat-embryo cold treatment). Siedem z pośród nich wykazało specyficzną ekspresję w odpowiedzi na wernalizację.

Northern Blot
Preparat RNA poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym w warunkach denaturujących. Po barwieniu bromkiem etydyny widać dwa prążki – dwie większe cząsteczki rybosomowego RNA (rRNA), występujące obficie w większości komórek. Mniejsze rRNA, których także jest dużo, są niewidoczne, gdyż są tak małe, że wypływają z żelu. W większości komórek żaden z informacyjnych RNA (mRNA) nie występuje tak licznie, by utworzyć prążek widoczny po barwieniu bromkiem etydyny. Kwas nukleinowy z żelu przenosi się na błonę nylonową i – w tym przykładzie – hubrydyzuje z wyznakowanym fragmentem DNA. Na autoradiogramie widać jeden prążek wskazujący, że fragment DNA użyty jako sonda zawiera część lub całość jedenj sekwencji ulegającej ekspresji.

.
.
Zobacz również:
PCR
RT-PCR
Real-time PCR
Multipleks PCR
Nested PCR
MLPA PCR

Literatura:


1. „Genomy” T.A. Brown
2. © 1998-2005 NAGRP - US Pig Gene Mapping Coordination Program:
http://www.genome.iastate...tech/ddpcr.html
3. S. Colonna-Romano, A. Leone, B. Maresca (1998) „Differential-Display Reverse Transcription-PCR (DDRT-PCR)”
4. C. Shindo, T.Sasakuma (2002) Genes responding to vernalization in hexaploid wheat

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

159 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Patronat

Wydarzenie: V edycja akcji „Od laika do przyrodnika” 24 lutego -16 czerwca 2017 r., Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Konferencja: IV Lubelska Konferencja Młodych Naukowców, 26-27 Maja 2017, Lublin

Konferencja: VI Międzynarodowa Konferencja Biofizyków, 19-21 Maja 2017, Kraków

Konkurs na projekt badawczy Naukowej Fundacji Polpharmy, 1 marca- 31 maja 2017, Warszawa

Konferencja: VI Międzyuczelniane Sympozjum Biotechnologiczne SYMBIOZA, 26-28 Maja 2017, Warszawa

Konferencja: Chemia dla Urody i Zdrowia
8-10 czerwca 2017, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Wydarzenie: Metagenomy różnych środowisk, 29-30 czerwca 2017, Lublin

Wydarzenie: EUROBIOTECH 6th Central European Congress of Life Science
11 - 14 Września 2017, Kraków

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u