biotechnologia


 
 

Test ELISA

Test ELISA (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), czyli test immunoenzymatyczny (ang. Enzyme Immunoassay - EIA) odkryty został w latach 60-tych XX wieku przez dwie niezależne grupy badawcze: Petera Perlmanna i Evaę Engvall z Uniwersytetu w Sztokholmie oraz Antona Schuursa i Baukea van Weemen z Holandii.
Choć obie nowopoznane techniki różniły się od siebie metodyką wykonania, to ich cechą wspólną było wykorzystanie enzymów do wykrywania reakcji antygenów ze swoistymi przeciwciałami. Stanowiło to obiecującą alternatywę dla stosowanych powszechnie testów radioimmunologicznych (ang. Radioimmunoassay - RIA), bazujących na szkodliwym dla zdrowia, radioaktywnym znakowaniu.

Początkowo test ELISA wykorzystywany był jedynie do wykrywania przeciwciał zawartych w surowicy (np. test na HIV). Jednak za jego pomocą, można również analizować ilość antygenów w badanej próbce. Szybki i czuły, stał się podstawowym testem klinicznym, służącym zarówno do celów naukowych jak i diagnostycznych. Znalazł również zastosowanie w przemyśle spożywczym (przy wykrywaniu alergenów takich jak jajka, migdały, orzeszki ziemne), toksykologii oraz rolnictwie.

Testy ELISA standardowo wykonywane są na polistyrenowych lub pleksiglasowych, 96-dołkowych płytkach, składających się z 8 rzędów i 12 kolumn. Wszystkie analizowane próby znajdują się w osobnych studzienkach. Płytkę opłaszcza się odpowiednim antygenem lub przeciwciałem. Aby zapobiec nieselektywnemu wiązaniu się białek do fazy stałej podczas następnych etapów testu, wolne miejsca blokuje się za pomocą roztworu owoalbuminy lub odtłuszczonego mleka.

Łączenie się antygenu ze specyficznym przeciwciałem (reakcja antygen-przeciwciało) uwidacznia reakcja barwna, powstająca dzięki odpowiednim enzymom. Najczęściej stosowane enzymy to:

- fosfataza alkaliczna (przekształca bezbarwny fosforan p-nitrofenolu w żółty p-nitrofenol),

- peroksydaza chrzanowa (daje niebieskie zabarwienie w obecności tetrametylobenzydyny),

- oksydaza glukozowa(z kwasem 5-aminosalicylowym daje kolor brunatny).

Zmiana barwy roztworu mierzona jest spektrofotometrycznie, a uzyskany wynik porównuje się z próbami kontrolnymi tworzącymi tzw. krzywą kalibracyjną. W celu jej uzyskania wykonuje się szereg roztworów o znanych rozcieńczeniach. Umieszcza się je na płytce i poddaje takim samym zabiegom, co próby badane. Zapewnia to właściwą ocenę stężenia analitu. Z powstałego w ten sposób wykresu odczytuje się zawartość białka w badanym materiale. Generalnie im mniejsze jest jego stężenie, tym gęstość optyczna jest bardziej zbliżona do zera.


Test ELISA - odmiany


Do najważniejszych należą:

- Test bezpośredni (ang. direct ELISA)



Rys. 1. ELISA – test bezpośredni


Podłoże opłaszcza sie antygenem, a następnie inkubuje z roztworem swoistego przeciwciała połączonego z odpowiednim enzymem. Po dodaniu właściwego substratu mierzy się intensywność uzyskanego zabarwienia i na tej podstawie szacuje się zawartość białka w badanej próbie.
Metoda ta jest szybka i prosta w wykonaniu. Jednak aby wykryć antygen trzeba wyznakować swoiste przeciwciała. Jest to kosztowne i nie zawsze możliwe.


- Test pośredni (ang. indirect ELISA)



Rys. 2. ELISA – test pośredni


Płytkę opłaszcza się antygenem, a następnie przeprowadza inkubację z roztworem przeciwciała pierwszorzędowego (ang. primary antibody). Nie jest ono wyznakowane, jednak łączy się jedynie z badanym białkiem. Powstały kompleks uwidacznia się za pomocą przeciwciała drugorzędowego (ang. secondary antibody), specyficznego dla globuliny zwierzęcej budującej dany izotyp immunoglobuliny pierwszorzędowej. Związane jest ono z enzymem i po dodaniu odpowiedniego substratu warunkuje uzyskanie barwnej reakcji.
Jest to najczęściej stosowany rodzaj testu ELISA. Jego zaletą jest to, że nie trzeba znakować swoistych dla antygenu przeciwciał pierwszorzędowych. Jest on jednak bardziej pracochłonny niż test bezpośredni.


- Test podwójnego wiązania - kanapkowy (ang. sandwich ELISA)



Rys. 3. ELISA – test podwójnego wiązania


W tym wariancie płytkę opłaszcza się przeciwciałami specyficznymi dla badanego białka. Przeprowadza się inkubację z antygenem, a następnie z roztworem swoistej immunoglobuliny. Oba przeciwciała wykazują powinowactwo do innych fragmentów badanego białka i dzięki temu tworzą razem z antygenem przypominające kanapkę warstwy. Całość inkubuje się roztworem przeciwciała drugorzędowego, wyznakowanego odpowiednim enzymem. Można również wyznakować przeciwciała pierwszorzędowe. Po dodaniu odpowiedniego substratu uzyskuje się reakcję barwną.
Metoda ta pozwala na ilościowe oznaczenie konkretnego białka w badanym materiale. Łączy się ono z przeciwciałami unieruchomionymi na płytce. Reszta białek zostaje wypłukana z próby. Taki test można również stosować do wykrywania immunoglobulin za pomocą specyficznego antygenu.


- Test kompetycyjny - rywalizacyjny (ang. competitive ELISA - cELISA)

Wykorzystuje współzawodnictwo mieszaniny różnych przeciwciał o miejsca wiązania na antygenie. Do opłaszczonej odpowiednim białkiem fazy stałej dodaje się badaną surowicę oraz wyznakowane przeciwciała. Intensywność uzyskanej reakcji barwnej będzie w tym wypadku odwrotnie proporcjonalna do stężenia immunoglobulin zawartych w surowicy.


Autor: Anna Kurcek

Literatura:
• Rudolf M. Lequin “Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”; Clinical Chemistry. 2005;51:2415-2418;
• Stewart L. Fossceco, Knoll Pharmaceutical Company, Whippany, NJ.and Nathan A. Curtis, SAS Institute Inc., Cary, NC “Exploring Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Data with the SAS® Analyst Application”
• dr Joanna Skubis-Zegadło “ELISA ( ang. enzyme-linked immunosorbent assay)”; 2009; metlab.pl;


Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

128 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u