biotechnologia


 
 

Izolacja białek

alfa amylaza
Rys. 1. Struktura alfa amylazy
W jakim celu izoluje się białka?
- dla lepszego poznania mechanizmów procesów biochemicznych zachodzących w żywych organizmach poprzez poznanie ich poszczególnych składowych - białek, oraz tego w jaki sposób ze sobą współdziałają. Wiedza ta może być szczególnie przydatna do projektowania lekarstw oraz procesów przemysłowych, opracowywania nowych pestycydów.
- zastosowania medyczne – wiele białek wytwarzanych w żywych organizmach może być użyte zamiast ich syntetycznie otrzymywanych analogów. Przykładem może być insulina, używana w terapii cukrzycy oraz czynnik VIII używany w leczeniu hemofilii. Inne białka mogą być zastosowane w diagnostyce medycznej, jak np. oksydaza glukozowa lub peroksydaza, które używa się do mierzenia poziomu glukozy w płynach ustrojowych, takich jak krew i uryna.
- zastosowania przemysłowe – wiele enzymów znalazło zastosowanie w procesach przemysłowych, opartych na materiałach pochodzenia biologicznego.

Białka izoluje się w inny sposób niż związki niskocząsteczkowe. Wynika to przede wszystkim z ich właściwości:
- białka są labilne – są to duże i elastyczne związki organiczne, ich kształt może być łatwo zmieniony w procesie zwanym denaturacją, która jednocześnie pozbawia je biologicznej aktywności. Oznacza to, że do izolacji mogą być użyte jedynie procedury bardzo łagodne. Gotowanie i destylacja są wykluczone.
- białka są do siebie bardzo podobne. Zbudowane są zasadniczo z tych samych aminokwasów, różnią się jedynie proporcjami między nimi, ich ilością oraz budową przestrzenną. Dlatego też wymagane są techniki bardzo selektywne i subtelne.

Trudności w izolacji białka
Białka syntetyzowane są jedynie przez organizmy żywe. Żeby wyizolować białko należy je oczyścić z biologicznego materiału, w jakim się znajdują. Poza tym trzeba je również oddzielić od innych białek obecnych w próbce. Jest to najtrudniejszy etap, ponieważ tak jak zostało powiedziane powyżej, białka są do siebie bardzo podobne. Idealną sytuacją byłaby izolacja całego interesującego nas białka bez żadnych strat oraz usunięcie wszystkich pozostałych białek. Rzadko jednak udaje się uzyskać taki efekt. Procedura izolacji powinna składać się z jak najmniejszej ilości kroków i powinna zostać przeprowadzona w jak najkrótszym czasie.

Izolacja białka – założenia ogólne
Zabierając się do izolacji musimy wiedzieć jak zmierzyć całkowitą zawartość białek w próbce oraz jak odróżnić nasze białko od pozostałych. Musimy korzystać tutaj ze znajomości biologicznej aktywności naszego białka. Dobrze jest posiadać dodatkowo próbkę zawierającą dużą ilość poszukiwanego przez nas białka. Białka z badanej próbki musimy zawiesić w jakimś roztworze. Można to uzyskać poprzez homogenizację materiału w buforze o małej sile osmotycznej (niskie ciśnienie osmotyczne pomaga w lizie komórek i organelli). Materiał musi być klarowny, uzyskujemy to poprzez ekstrakcję, wirowanie. Oczyszczona próbka może być poddana procesowi frakcjonowania poprzez np. wysalanie. Jest to etap konieczny do przeprowadzenia. Inaczej nie będziemy w stanie uzyskać interesującego nas, konkretnego białka. Uzyskany materiał poddajemy kolejnym procesom frakcjonowania aż do pozyskania czystego białka.
Do izolacji białka szczególnie szerokie zastosowanie zyskała chromatografia, w szczególności zaś chromatografia powinowactwa. Uważa się, że powinna być używana do tego jak najczęściej, ponieważ w szybkim czasie pozwala na uzyskanie pożądanego efektu, a poza tym wymaga chyba najmniejszej ilości kroków.
Skąd powinniśmy wiedzieć, kiedy białko już jest wystarczająco czyste żeby przerwać proces izolacji? Istnieje szereg metod analitycznych, które pozwalają nam na określenie czystości białek. Jeśli wykażą obecność w roztworze tylko jednego białka możemy przerwać izolacje będąc pewnymi, że efekt został osiągnięty. Niestety obecna technologia nie umożliwia nam ustalenie poziomu wszystkich zanieczyszczeń, które mogą znajdować się w naszej próbce. Generalnie potrzebujemy dwóch metod analitycznych pozwalających na monitorowanie badanego materiału. Pierwsza powinna badać ilość poszukiwanego przez nas białka, druga jego aktywność. Aktywność białka powinna wzrastać wraz z postępującą izolacją. Staje się to logiczne, jeśli uzmysłowimy sobie, że poszukiwanego białka powinno być w próbce coraz więcej w stosunku do innych białek i zanieczyszczeń.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

80 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u