biotechnologia


 
 

ISSR

probówkiISSR-PCR jest to prosta i szybka metoda, która łączy większość zalet SSR , ALFP i powszechnie stosowanego RAPD. Markery ISSR są wysoce polimorficzne i użyteczne w badaniach nad różnorodnością genetyczną, znakowaniem i mapowaniem genów.

Markery DNA dostarczają cennych informacji na temat hodowli roślin, głównie w przypadku badań nad różnorodnością genetyczną i mapowaniem genów. Popularne systemy markerowe DNA opierające się na powszechnym użyciu reakcji PCR to RAPD, AFLP i SSR. Niestety metody te charakteryzują się wieloma ograniczeniami: niskim poziomem powielania przez RAPD, wysokim kosztem analizy w AFLP i koniecznością posiadania wiedzy na temat flankujących sekwencji w przypadku polimorfizmu SSR. ISSR-PCR jest wolny od większości tych ograniczeń..

ISSR jest techniką, która polega na amplifikacji fragmentów DNA położonych pomiędzy dwoma mikrosatelitarnymi, powtórzonymi regionami, zorientowanymi w przeciwległych kierunkach. Technika ta wykorzystuje mikrosatelity, głównie o długości 16-25 bp, jako primery. Primery te mogą być di-, tri-, tetra-, albo pentanukleotydami. ISSR ma dużą zdolność powielania, być może z powodu używania dłuższych primerów (16-25 zasad) w porównaniu z RAPD wykorzystującym primery 10cio zasadowe, co pozwala w późniejszym etapie na użycie wyższych temperatur annilingu (45-60 ºC).

Markery ISSR to najczęściej markery dominujące dziedziczące się jako proste jednostki mendlowskie. Jednakże naukowcy wykazali, ze ISSR także segregują jako markery kodominujące, co umożliwiło prowadzenie badań nad odrębnością pomiędzy homozygotami i heterozygotami.

Ponieważ tempo zmian ewolucyjnych w odniesieniu do mikrosatelit jest znacznie wyższe niż w przypadku innych typów DNA, dlatego też poziom polimorfizmu w tych sekwencjach jest dużo wyższy.

Polimorfizm ISSR wynika z mutacji, insercji lub delecji w obrębie regionu SSR. Zmiany te powodują wystąpienie lub nie, produktu, który stanie się widoczny na żelu w postaci prążka. Do zwiększenia polimorfizmu i zmienności były stosowane primery niezakotwiczone, zakotwiczone na końcu 3’ lub zakotwiczone na końcu 5’. Produkty amplifikowane dzięki primerom zakotwiczonym na końcu 5’ zawierały sekwencje mikrosatelitarne, a ich długość różnicowała się w poprzek genomu i dlatego dawały więcej prążków i wyższy stopień polimorfizmu. Primery zakotwiczone na końcu 3’ dają jaśniejszy wzór prążków w porównaniu do zakotwiczonych na końcu 5’. Zazwyczaj primery zawierające sekwencje powtórzone (AG), (GA), (CT), (TC), (AC), (CA) wykazują wyższy polimorfizm niż primery z innymi di-, tri- albo tetranukleotydowymi powtórzeniami. Powtórzenia (AT) występują dość obficie w roślinach, natomiast tri- i tetranukleotydy występują z mniejszą częstotliwością, a ich użycie w technice ISSR jest dużo rzadsze. Primery zawierające powtórzenia (AC) były szczególnie pomocne w badaniach pszenicy i ziemniaka.

ISSR-PCR jest prostą, szybką i efektywną techniką. Ma wysoką powtarzalność. Nie jest tutaj konieczne użycie materiałów radioaktywnych. Primery nie są zastrzeżone (jak w SSR-PCR) i mogą być syntetyzowane przez każdego. Możliwe są zmiany długości primera, motywu, miejsca zaczepienia. Primery są długie, co skutkuje wysoką specyficznością. Amplifikowane produkty (markery ISSR) mają zwykle 200-2000 bp długości i możliwa jest ich detekcja zarówno z użyciem elektroforezy w żelu agarozowym jak i poliakrylamidowym.

Głównymi obszarami zastosowania ISSR-PCR dla roślin uprawnych są: genomowy fingerprinting, badanie zróżnicowanie genetycznego oraz analizy filogenetyczne.

Fingerprinting DNA jest bardzo istotnym narzędziem służącym do charakterystyki zasobów genowych, ustalania tożsamości odmian, hybryd, źródeł rodzicielskich itp. Oparte na dwóch powtarzalnych nukleotydach primery ISSR przyłączające się do końca 5’ lub 3’ były wykorzystane w badaniach fingerprinting z dużą skutecznością w celu charakterystyki kolekcji kakaowca. Ponadto ISSRy wykazywały polimorfizm wystarczający do odróżnienia różnych odmian chryzantem, a rośliny pochodzące z mikrospor mogły być odróżnione od tych, które pochodziły z tkanek somatycznych w kulturach pylników lnu.

ISSRy były z powodzeniem wykorzystywane do oceny stopnia różnorodności genetycznej dużej liczby gatunków roślin uprawnych włączając: ryż, pszenicę, proso, słodki ziemniak i Plantago. W tym przypadku przewaga ISSR-PCR nad innymi technikami markerowymi została potwierdzona licznymi badaniami. Stwierdzono, że przyłączone primery SSR są bardziej przydatne i powtarzalne niż izoenzymy, RFLP i RAPD (analiza różnorodności zasobów genowych trójlistnej pomarańczy). Ponadto ISSRy były bardziej użyteczne w analizie różnorodności rodzaju Elusine pod względem jakości i ilości uzyskanych danych w porównaniu z RFLP i RAPD. Znaczna efektywność techniki potwierdzono również w charakterystyce dokonanej na różnym poziomie gatunkowym.

Markery ISSR są niemapowalne, ale mogą być użyte do uzupełniania map powiązanych z RFLP i SSR. Mapa RFLP jęczmienia została wysycona przez 60 ISSRów (określonych w badaniach jako RAMPy), które mapowały wszystkie chromosomy. Wiele z tych markerów zostało zmapowanych pomiędzy grupami markerów RFLP, flankowały one grupy RFLP na końcach chromosomów i co ważniejsze w obszarach o niskiej gęstości markerów RFLP.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

126 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u