biobiobio


 

Markery genetyczne

probówkiUżycie markerów molekularnych do poszukiwania loci i regionów genomu w roślinach zbożowych jest obecnie rutynowo stosowane w wielu programach hodowlanych. Dzięki temu znane jest obecnie położenie głównych loci dla wielu genów odporności na choroby, tolerancji na stres abiotyczny oraz determinujących cechy jakościowe. Postęp technik screeningu (wykrywanie) markerów jest bardzo ważny gdyż znacznie ułatwia poszukiwanie genów. Aby markery były efektywne muszą być blisko związane z badanym locus i pozwalać na analizę polimorfizmu w materiale wykorzystywanym w programie hodowlanym. Markery pozwalają na selekcję pożądanych form, ocenę wyrównania materiałów hodowlanych, ich stopnia homozygotyczności, potwierdzenia skuteczności prowadzonych krzyżowań oraz oceny czystości nasion mieszańcowych. Stanowią one znaczniki sprzężonych z nimi cech fenotypowych o znaczeniu użytkowym. Markery ponadto przyczyniły się do ulepszenia strategii określania położenia genów i poprawiły zrozumienie genetycznej kontroli cech złożonych takich jak: komponenty jakościowe i szeroko pojęte zdolności adaptacji. Najczęściej wykorzystywane metody do identyfikacji sprzężeń marker-cecha bazują na konstrukcji, fenotypowaniu i genotypowaniu przy użyciu markerów molekularnych specjalnych populacji. Takie populacje są generalnie skonstruowane z dwóch odmian, które wykazują znaczące różnice w cechach, które mają być mapowane. Genetyczna struktura tych populacji może być zachowana przez otrzymywanie podwojonych haploidów albo rekombinowanych linii wsobnych. Tego typu populacje stają się głównym źródłem materiału do badań o szerokim zakresie. Wiele takich populacji stało się międzynarodowym zasobem wykorzystywanym przez naukowców na całym świecie.

Markery morfologiczne takie jak kształt liścia czy karłowatość, były pierwszymi, wykorzystywanymi na szeroką skalę do analizy genetycznej. Nie znalazły jednak wielu zastosowań, ze względu na ich liczne wady, takie jak: ograniczona liczba, zależność od modyfikującego wpływu środowiska, złożone podłoże genetyczne oraz trudności w odróżnianiu homozygot od heterozygot.

Oprócz markerów morfologicznych wykorzystywano markery białek strukturalnych (białka zapasowe) oraz białek funkcjonalnych (izoenzymy). Izoenzymy zostały opracowane w latach pięćdziesiątych ubiegłego wieku i były pierwszymi markerami umożliwiającymi badanie struktury genetycznej populacji, szacowanie stopnia polimorfizmu oraz heterozygotyczności, a także badanie podobieństwa genetycznego i czystości genetycznej. Obecnie izoenzymy mają mniejsze znaczenie w analizie genetycznej, jednak wciąż pozostają użyteczne w procesach hodowli roślin. Markery te nie podlegają wpływom środowiskowym, dziedziczą się jak proste jednostki mendlowskie oraz są kodominujące. Dzięki izoenzymom poznano wielogenową rodzinę kodującą α-amylazę, czyli enzym odpowiedzialny za hydrolizę skrobi w czasie kiełkowania ziarna zbóż. Pozwoliło to na wyróżnienie grupy genów α-Amy1 zlokalizowanych na chromosomach grupy szóstej u Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Secale cereale, grupy α-Amy2 na chromosomach grupy siódmej, oraz α-Amy3 na chromosomach grupy piątej. Zostały one wykorzystane również w badaniach nad wprowadzeniem do hodowli pomidora markera Rex-1, sprzężonego z odpornością na nicienie oraz w opracowaniu analizy locus Pgi-2 w celu charakteryzacji materiałów hodowlanych kapusty. Jednakże markery izoenzymatyczne nie sprawdziły się w badaniach nad całościową charakterystyką genomów roślinnych oraz w konstruowaniu map genetycznych. Wynika to z faktu małego polimorfizmu białek enzymatycznych oraz konieczności opracowywania osobno dla każdego enzymu metodyki rozdziału, barwienia lub ekstrakcji.

W ciągu ostatnich dwudziestu lat największego jednak znaczenia nabrały markery molekularne oparte na kwasach nukleinowych. Zasadniczy przełom w diagnostyce molekularnej nastąpił z chwilą opracowania markerów RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) opartych na analizie długości fragmentów restrykcyjnych DNA. Polega ona na generowaniu pewnego spektrum fragmentów DNA, powstających najczęściej w wyniku trawienia enzymami restrykcyjnymi, które rozpoznają określone miejsca i specyficznie trawią DNA. Fragmenty te rozdziela się następnie metodą elektroforezy na żelu agarozowym i przenosi na membrany. Identyfikacja polimorfizmu odbywa się z udziałem znakowanych sond komplementarnych do homologicznych fragmentów na membranach. Polimorfizm RFLP wynika głównie z mutacji obejmujących miejsca restrykcyjne lub duplikacji, delecji czy insercji w pobliżu miejsc restrykcyjnych, co zmienia odległość między miejscami trawienia.

Metody wykorzystujące RFLP są przydatne głównie do monitorowania roślin poddanych kwarantannie czy rozmnażanych in vitro, ponieważ umożliwiają wykrycie w tkance roślinnej obcego DNA pochodzącego np. od patogena. Wykorzystuje się je także do analizy polimorfizmu DNA mitochondrialnego i chloroplastowego oraz w badaniach filogenetycznych i taksonomicznych, a także do identyfikacji różnych form męskiej sterylności.

Kolejną grupę markerów molekularnych stanowią markery uzyskiwane metodą PCR (Polymerase Chain Reaction). Należą do nich między innymi markery STS (Sequence Tagged Site) czyli miejsca znaczone sekwencyjnie. Markery STS są wykorzystywane do zagęszczania map genetycznych oraz poszukiwania sprzężeń z cechami użytkowymi. Klasyczny marker STS (Sequence Tagged Site), czyli miejsce znaczone sekwencyjnie jest fragmentem o długości 200-300 pz otrzymywanym metodą PCR z użyciem specyficznych starterów projektowanych w oparciu o znajomość sekwencji całego fragmentu. Zapewniają one wysoką specyficzność ampifikacji, potwierdzoną jednoprążkowym obrazem rozdziału produktów reakcji PCR na żelu, w której matrycą był genomowy DNA. Obecność markera STS w dwóch klonach biblioteki genomowej oznacza, że zawierają one sekwencje częściowo się pokrywające. Markery STS mogą więc służyć do uporządkowania klonów biblioteki DNA w kontigi ciągi częściowo zachodzących na siebie sekwencji). Szczególnym przypadkiem markerów STS są specyficzne znaczniki ekspresji (EST). Reprezentują one znaną, unikatową sekwencję klonu cDNA, amplifikowana dzięki starannie dobranym sekwencjom starterów. Posługiwanie się starterami EST daje pewność identyfikowania sekwencji kodującej jednego genu. Aby marker EST mógł spełniać to zadanie wobec matrycy stanowiącej genomowy DNA, miejsca przyłączenia starterów powinny znajdować się w obrębie eksonu. Klasyczny marker STS Charakteryzuje się niskim polimorfizmem, który nie pozwala na wykrycie form allelicznych, ponieważ nie różnią się one długością amplifikowanych fragmentów.

Markery molekularne projektuje się także w oparciu o proste sekwencje powtórzone. Są to markery SSR (Simple Sequence Repeats), czyli amplifikowane sekwencje mikrosatelitarne. Mikrosatelity występują na wszystkich chromosomach i charakteryzują się silnym polimorfizmem ze względu na ich długość oraz różną ilość powtórzeń sekwencji podstawowej . Uważa się, że częściej występują one na obszarze euchromatyny aniżeli heterochromatyny, a ich skupienia zostały wykryte zarówno w centromerach jak i w telomerach. Ze względu na dużą specyfikę genomową, markery te są opracowywane indywidualnie dla każdego gatunku. Wykorzystuje się je z powodzeniem do mapowania i selekcji pożądanych genotypów. Ponadto stanowią one bardzo ważne narzędzie do badania struktury populacji, zróżnicowania genetycznego oraz przy DNA fingerprintingu. Ellis i in. (2005) prowadzili badania nad markerami SSR sprzężonymi z genami karłowatości u pszenicy. Celem ich pracy było zmapowanie najbardziej obiecujących genów karłowatości oraz identyfikacja sprzężonych z nimi markerów mikrosatelitarnych, które pozwolą na wykorzystanie tych genów w programach hodowlanych. W wyniku prowadzonych badań zlokalizowali na chromosomach geny Rht4, Rht5 i Rht13. Ponadto opracowali nowe markery SSR dla Rht8 i Rht12. Kuleung i in. (2004) oraz Gupta i in. (2003) podejmowali próby transferu markerów mikrosatelitarnych pomiędzy różnymi gatunkami roślin zbożowych w celu ułatwienia w przyszłości prowadzenia prac hodowlanych. Markery mikrosatelitrne były również wykorzystywane do badania odporności pszenicy na różnego rodzaju patogeny takie jak mszyca Diuraphis noxia, czy wirus żółtej mozaiki pszenicy.

Znajomość chromosomowej lokalizacji tych markerów sprawia, że są one użytecznym narzędziem przy ocenie zróżnicowania genetycznego odmian pszenżyta ozimego. Poza markerami SSR w ostatnich latach zostały również opracowane markery SCAR (Sequence-Characterised Amplified Region), czyli polimorfizm produktów powielania zsekwencjonowanego regionu, charakteryzujący głównie wariant jakiegoś genu. Markery SCAR były wykorzystywane do oceny zróżnicowania genetycznego pomiędzy odmianami i liniami pszenżyta. Analizowano 22 markery SCAR, z których pięć nie wykazywało polimorfizmu u badanych form. Pozostałych 17 markerów różnicowało wszystkie badane genotypy. Wszystkie użyte przez autorów markery były specyficzne dla genomu R wywodzącego się z Secale cereale, w związku z czym zaobserwowany polimorfizm odzwierciedla zróżnicowanie występujące tylko w obrębie żytniej części genotypów pszenżyta.

Sekwencje mikrosatelitarne stanowią również podstawę do projektowanie starterów umożliwiających otrzymywanie „odcisku palca” genotyp[ów roślinnych. Ziętkiwicz i in. (1994) przedstawili prostą metodę generowani złożonych obrazów prążkowych, wykorzystującą polimorfizm odcinków DNA pomiędzy sekwencjami mikrosatelitarnymi (ISSR). W metodzie tej stosuje się jeden starter o długości 17-18 nt, na który składa się sekwencja powtórzona, np. (CA)8 i 1-2 nt selekcyjnych na końcu 3’, warunkujących przyłączenie startera do miejsc styku mikrosatelity z unikatowym DNA. Starter może być również zakotwiczony na końcu 5’, za pomocą 2-3 nt. Elektroforeza otrzymanych metodą ISSR licznych produktów amplifikacji prowadzona jest w poliakrylamidowym żelu sekwencyjnym. Detekcja prążków odbywa się na autoradiogramach lub bezpośrednio w żelu przez barwienie azotanem srebra.

Najprostszą techniką pozwalającą na wykrycie zróżnicowania DNA jest opracowana przez Williamsa i in. metoda RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) wykorzystująca losowo amplifikowany polimorficzny DNA. Reakcja amplifikacji prowadzona jest z użyciem jednego, dziesięcionukleotydowego startera o arbitralnej (dowolnie wybranej) sekwencji, co pozwala uzyskać od kilku do kilkunastu produktów. Fragmenty zostają rozdzielone w żelu agarozowym i wybarwione bromkiem etydyny. Metodę RAPD upraszcza się dodatkowo na etapie ekstrakcji DNA, która może się sprowadzać do podgrzania buforu z zanurzonym skrawkiem liścia do temperatury 95°C przez 15 min lub umieszczenia drobnego fragmentu tkanki bezpośrednio w mieszaninie PCR. Ze względu na praktycznie nieograniczoną liczbę różnych sekwencji dziesięcionukleotydowych starterów, metoda RAPD stała się szczególnie przydatna do poszukiwania markerów ważnych cech użytkowych, w konstrukcji map genetycznych i w ocenie podobieństwa genetycznego taksonów roślinnych. W aspekcie identyfikacji genotypów interesująca wydaje się modyfikacja metody RAPD, wykorzystująca sekwencję styku intron-ekson. Ujemną stroną omawianej metody jest generowanie dominujących markerów oraz konieczność preselekcji starterów, które dają stabilne i wyraźne elektroforegramy. Stwierdzono dużą wrażliwość reakcji amplifikacji markerów RAPD na zmianę stężenia i źródła pochodzenia polimerazy Taq, wahania w ilości ekstraktu z tkanki roślinnej, zawartości kationów magnezu i potasu. Wszystko to przekonuje o konieczności zapewnienia jednolitych warunków amplifikacji oraz używania starterów generujących stabilne profile prążków RAPD. Polimorfizm RAPD jest wynikiem mutacji w obrębie sekwencji komplementarnych do końca 3’ startera oraz delecji lub insercji w pewnej odległości od miejsca wiązania startera. Kojima i in. (1998) podają, że w przypadku RAPD istotnym źródłem zmienności mogą być także sekwencje repetytywne. Metoda ta znalazła szerokie zastosowanie w poszukiwaniu markerów wielu cech użytkowych, konstruowaniu map genetycznych oraz ocenie podobieństwa genetycznego pomiędzy gatunkami. Jest to metoda prosta i szybka, ale niestety bardzo wrażliwa na wszelkiego rodzaju zmiany warunków reakcji amplifikacji.

Równolegle do metody RAPD zostały opracowane dwie podobne techniki, wykorzystujące amplifikację z użyciem arbitralnych, krótkich starterów. Fingerprinting przez amplifikację DNA (DAF) polega na amplifikacji DNA z użyciem 8-10-nukleotydowych starterów i rozdziale otrzymanych produktów w denaturującym żelu poliakryloamidowym. Natomiast metoda przedstawiona w pracy Welsh i McClelland wykorzystująca arbitralne startery PCR (AP-PCR), polega na amplifikacji z udziałem starterów o długości 20 i więcej nukleotydów, której pierwsze dwa cykle przebiegają w niższej temperaturze fazy renaturacji (40°C), a następne w temperaturze właściwej dla użytych starterów (ok. 60°C). O ile w pierwszym etapie powstaje wiele niespecyficznych połączeń startera z matrycą, o tyle w drugiej fazie selekcjonowane są tylko wysoce homologiczne produkty hybrydyzacji. Produkty są znakowane radioaktywnie i rozdzielane w denaturującym żelu poliakryloamidowym. Grupa trzech metod korzystających z arbitralnych starterów (RAPD, DAF i AP-PCR), które umożliwiają amplifikację anonimowych miejsc na matrycy DNA (tzw. amplikonów) określana jest, jako wielokrotne, arbitralne profilowanie amplikonów (MAAP) lub po uwzględnieniu metody MP-PCR - łączona w grupę reakcji amplifikacji z użyciem jednego startera (SPAR). Ze względu na największą prostotę wykonania, najniższe koszty i szybkość, najczęściej w praktyce badawczej wykorzystuje się technikę RAPD.

Kolejną techniką jest AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism). Jej zaletą jest możliwość identyfikacji dużej liczby markerów w stosunkowo krótkim czasie i wysoka powtarzalność. Metoda ta wymaga małej ilości materiału wyjściowego i polega na badaniu obecności lub braku amplifikacji specyficznych fragmentów restrykcyjnych. Jest to w pewnym sensie połączenie zalet PCR i RFLP. W technice tej wykorzystuje się dwa enzymy restrykcyjne, z których jeden charakteryzuje się wyższą, a drugi niższą częstotliwością cięcia. Do fragmentów restrykcyjnych dołączane są adaptory składające się z sekwencji rdzeniowej, oraz sekwencji specyficznej dla miejsca restrykcyjnego. W drugim etapie następuje amplifikacja fragmentów restrykcyjnych i ich rozdział na żelu poliakrylamidowym.

Technika AFLP może być wykorzystywana do identyfikacji odmian hodowlanych, oraz w badaniach nad zmiennością genetyczną, zmiennością wynikającą z różnic we wzorach metylacji DNA w obrębie jednego organizmu, a także jego klonów, jak również do badania ekspresji genów. Polimorfizm długości amplifikowanych fragmentów (AFLP) jest metodą umożliwiającą fingerprinting DNA, która łączy zalety PCR i RFLP. Pierwszy etap AFLP polega na trawieniu oczyszczonego DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi. Jeden z enzymów, rozpoznający sekwencje sześcionukleotydowe (np. EcoRI) przecina dwuniciowy DNA znacznie rzadziej niż drugi enzym (np, MseI) właściwy dla sekwencji czteronukleotydowych. Do tak otrzymanych fragmentów restrykcyjnych przyłączane są z obu stron krótkie adaptory. Dwa startery służące do preamplifikacji mają sekwencję komplementarną do części adaptorowej i miejsca restrykcyjnego oraz jeden selekcyjny nukleotyd na końcu 3'. Zadaniem nukleotydów selekcyjnych jest ograniczenie liczby amplifikowanych fragmentów. Po wstępnej amplifikacji, w mieszaninie reakcyjnej znajdują się liczne fragmenty DNA, które po rozcieńczeniu będą stanowić materiał matrycowy dla właściwej, selektywnej amplifikacji. Jest ona prowadzona z użyciem starterów, różniących się od tych z pierwszej fazy obecnością dwóch dodatkowych nukleotydów selekcyjnych na końcach 3'. Starter wiążący się z miejscem EcoRI jest wyznakowany izotopem 33P. Powielone fragmenty zostają rozdzielone w sekwencyjnym, denaturującym żelu poliakryloamidowym. Autoradiogram otrzymany po ok. 1 dniu ekspozycji składa się na ogół z ok. 50-100 prążków tworzonych przez wyznakowane, jednoniciowe fragmenty EcoRI/MseI.. Ze względu na duże zagęszczenie prążków odczytywanie autoradiogramu znacznie ułatwia komputerowa analiza obrazu.

Mago i in. (2005) wykorzystali markery AFLP do badania odporności pszenicy na rdzę źdźbłową. Podjęto również próby konwersji markerów AFLP do markerów STS oraz użycie ich jako sond RFLP, ale nie osiągnięto w tej mierze sukcesów.

Wymienione powyżej techniki są w ostatnich latach najczęściej stosowanymi technikami molekularnymi. Oprócz nich istnieje wiele innych markerów, do których należą m.in. markery DDRT-PCR(Differential – Display Reverse Transcriptase – PCR). Stanowią one główne narzędzie do identyfikacji genów podlegających ekspresji w ściśle określonych tkankach, lub charakteryzujących się zróżnicowaną ekspresją, zależną od fazy wzrostu czy warunków środowiskowych (np. stresowych). Metoda ta umożliwia porównywanie składu mRNA zarówno w tkankach jednej rośliny jak i w liniach izogenicznych. Dzięki DDRT-PCR istnieje możliwość wykrycia markera molekularnego sprzężonego z locus ważnej cechy użytkowej lub identyfikacja samego genu.

Po wykryciu markera związanego z ważną cechą użytkową rośliny zachodzi potrzeba sprawdzenia możliwości jego wykorzystania w selekcji korzystnych genotypów wśród licznych na ogół materiałów hodowlanych. Wtedy często okazuje się, że procedura otrzymywania danego markera Jest niedostosowana do badań prowadzonych na szeroką skalę, w których przede wszystkim liczy się prostota, niezawodność oraz niski koszt analizy. Markery molekularne często poddaje się konwersji.

Marker RFLP nie jest wygodny w użyciu do analizy dużej liczby osobników (np. przy selekcji) ze względu na znaczny koszt metody, jej dużą pracochłonność i konieczność pobierania zbyt dużych ilości tkanki roślinnej. Można go przekształcać w bardziej efektywny marker STS. Wymaga to sekwencjonowania sondy RFLP i zaprojektowania specyficznych starterów, które umożliwią wykrycie polimorfizmu. W przypadku braku zróżnicowania długości produktów amplifikacji, rozdzielanych w żelu agarozowym, należy sprawdzić przydatność kilku innych metod zapewniających większą rozdzielczość. Pomocne są tu metody rozdziału w żelu poliakryloamidowym, takie jak: elektroforeza w denaturującym gradiencie (DGGE) lub elektroforeza w gradiencie temperatury (TGGE) Znaczną czułość wykrywania mutacji punktowych w badanym locus można osiągnąć analizując polimorfizm konformacji pojedynczych nici DNA (SSCP). Inną metodą detekcji polimorfizmu markerów STS jest trawienie produktów amplifikacji enzymami restrykcyjnymi i rozdział w żelu agarozowym. Otrzymywane w ten sposób markery stanowiące fragmenty restrykcyjne amplifikowanych sekwencji (CAPS) lub PCR-RFLP, są na ogół kodominujące.

Gdy polimorfizm RFLP pozwala na wykrycie allela silnie sprzężonego z allelem podwyższającym wartość genotypu, najlepszą metodą konwersji jest zamiana marka; RFLP w specyficzny allelicznie marker PCR (AS-PCR). Pomyślnie zakończoną procedurę konwersji markerów RFLP sprzężonych z genami warunkującymi wysoką wartość browarnianą H. vulgare w markery AS-PCR opisali Lee i Penner. W pierwszym etapie prac ustalono sekwencję sondy RFLP i zaprojektowano do niej specyficzne startery. Następnie oczyszczono produkty amplifikacji, otrzymane z linii H. vulgare kontrastowo różniących się pod względem wartości browarnianej. Po ich sekwencjonowaniu porównano allele i zidentyfikowano różnice między nimi. Na tej podstawie zaprojektowano parę starterów zdolnych do amplifikacji tylko jednego - korzystnego allela. Specyficzna allelicznie amplifikacja może się opierać nawet na jednonukleotydowej różnicy w sekwencji alleli, pod warunkiem, że sekwencji różnicująca allele jest zawarta w końcu 3' startera, a drugi starter odznacza się specyficznością w stosunku do badanego locus. Pary starterów specyficzne w stosunku do jednego allela mogą być wykorzystane w diagnostyce genetycznej na dużą skalę, gdyż umożliwiają wyeliminowanie z procedury badawczej etapu elektroforezy. Użycie allelicznie specyficznych starterów (ASAP) wiąże się z uproszczoną metodą ekstrakcji DNA w środowisku zasadowym i jego amplifikacja w płytkach mikrotitracyjnych. O obecności określonego allela w badanym materiale świadczy intensywność fluorescencji po dodaniu bromku etydyny do studzienek płytki. Odpowiednikiem metody ASAP jest allelicznie specyficzna hybrydyzacja (ASH). Jej pierwszy etap przebiega podobnie jak w metodzie AS-PCR. Inna jest natomiast strategia dobierania sekwencji oligonukleotydu pełniącego funkcję sondy rozpoznającej jeden z alleli. W sekwencji DNA zidentyfikowany zostaje polimorfizm jednego nukleotydu (SNP), a następnie projektuje się zestaw sond, różniących się pod względem tej jednej zasady w centralnej części sekwencji Tak przygotowana sonda hybrydyzuje specyficznie w technice dot-blot z unieruchomionym na filtrze produktem reakcji PCR tylko wtedy, gdy zawiera on właściwy allel.

Duża liczba prac zmierzających do wykrycia markera molekularnego ważnej cech użytkowej opiera się na prostej i stosunkowo taniej metodzie RAPD. Identyfikowany marker RAPD nie zawsze jednak kwalifikuje się do prac selekcyjnych na dużą skalę. Może się bowiem okazać, że prążek stanowiący marker występuje z niewielką częstością w szerszym materiale hodowlanym, nie wykazuje polimorfizmu w innej kombinacji krzyżówkowej lub jest niestabilny. W takim przypadku zachodzi potrzeba zamiany markera RAPD w sekwencyjnie charakteryzowany amplifikowany region (SCAR). Konwersja markera RAPD w marker SCAR jest złożoną procedurą, na którą składa się: wycięcie prążka RAPD z żelu, izolacja DNA, klonowanie fragmentu, ustalenie sekwencji i zaprojektowanie specyficznych starterów o długości 20-24 nt, dających jeden produkt amplifikacji o długości odpowiadającej wyjściowemu fragmentowi. Specyficzny, zdolny do wykrywania polimorfizmu, marker SCAR odznacza się dobrą powtarzalnością i pozwala wiarygodnie identyfikować genotypy w badanym locus. Inny sposób przystosowania markera RAPD do prac selekcyjnych na szerszą skalę przedstawili Penner i in. Wycięty z żelu prążek RAPD zostaje reamplifikowany, wyznakowany digoksygeniną i użyty jako sonda molekularna w hybrydyzacji plamkowej (dot-blot) z unieruchomionymi na filtrze produktami amplifikacji.

Próby otrzymania specyficznego markera z fragmentu AFLP często kończą się niepowodzeniem. Shan i in. wycięli z żelu, sklonowali i określili sekwencję 26 specyficznych chromosomowo markerów AFLP u T. aestivum. Tylko w sześciu przypadkach udało się otrzymać markery SCAR odpowiadające specyfiką swoim pierwowzorom. Inny, bardziej złożony sposób konwersji markera AFLP przedstawili Bradeen i Simon. Stosując metodę odwróconej PCR (i-PCR) wydłużyli oni fragment AFLP o regiony przylegające i po sekwencjonowaniu zaprojektowali startery przyłączające się do końców wydłużonych fragmentów.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Menu podręczne

Kto jest online

42 anonymous users oraz 0 registered users online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły.

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2013 e-biotechnologia.pl
stat4u