biotechnologia


 
 

Metody detekcji DNA

elektroforezaAutor artykułu: Marcin Pastwa.

Detekcja DNA w żelu


Metod detekcji kwasu DNA jest wiele. Większość z nich bazuje na wykorzystaniu barwników fluorescencyjnych, czyli substancji, przy użyciu których możemy zaobserwować obecność DNA, np. w żelu agarozowym. Wśród popularnych sposobów znakowania DNA wymienić należy: barwienie barwnikami fluorescencyjnymi (ich liczba ciągle wzrasta), solami srebra, oraz znakowanie radioizotopami.

Znakowanie radioizotopowe charakteryzuje się wysoką czułością, jednak ze względu na cenę oraz zagrożenie dla zdrowia (praca z substancjami promieniotwórczymi), jest w chwili obecnej zastępowane przez metody wykorzystujące barwniki fluorescencyjne.

W niniejszym artykule zajmiemy się najbardziej popularnymi, a jednocześnie stosunkowo czułymi metodami, jakimi są: barwienie bromkiem etydyny, oranżem akrydyny oraz solami srebra. Dzięki użyciu tych substancji możemy w łatwy i stosunkowo szybki sposób zidentyfikować obecność nici DNA w bardzo niewielkich stężeniach, rzędu ng (w przypadku bromka etydyny), do kilku pg (przy barwieniu azotanem srebra).


Maksimum absorpcji, fluorescencji i wartość wzbudzenia


Podstawowe pojęcia związane z fluorescencją to:

- maksimum absorpcji - długość promieniowania pochłaniana przez dany związek w sposób maksymalny względem innych długości promieniowania (każdy związek posiada swoje maksimum absorpcji przy określonej długości fali, charakterystycznej tylko dla niego)

- maksimum fluorescencji - długość promieniowania emitowana przez związek (pewne związki pod wpływem wzbudzenie emitują promieniowanie o określonej długości fali)

- wartość wzbudzenia - długość fali, którą wzbudzamy fluorochrom.


Oranż akrydyny


Związek organiczny o nazwie systematycznej 3,6-dimetylaminoakrydyna jest substancją posiadającą różne właściwości spektralne w zależności od formy, w jakiej występuje. W zależności od jego stężenia w roztworze, może występować jako monomer lub jako dimer. Maksimum absorpcji dla monomeru (rozcieńczenie rzędu 10 do -7 ÷ 10 do -2 ) wynosi 494 nm, dając przy tym zieloną fluorescencję o maksimum 520 nm. Przy odpowiednio wysokim stężeniu w roztworze oranż zaczyna polimeryzować. Maksimum absorpcji dimerów wynosi 465 nm, natomiast fluorescencji 650 nm. Oranż akrydyny tworzy dwa typy kompleksów: A oraz B. Kompleks typu A, w wyniku interkalacji monomerów pomiędzy zasady w podwójnej nici DNA (lub dsRNA), wykazuje maksimum absorpcji przy długości fali 502 nm. Kompleks typu B powstaje w sytuacji agregacji cząsteczek oranżu na pojedynczej nici RNA, bądź zdenaturowanej, pojedynczej nici DNA. Maksimum absorpcji dla tego kompleksu wynosi 475 nm.

Oranż akrydyny stosuje się także do barwienia żywych oraz utrwalonych komórek. Wzór barwienia poszczególnych organelli jest odmienny.

oranż akrydyny Oranż akrydyny


Barwienie srebrem


Azotan srebra jest stosowany do barwienia DNA, białek oraz lipopolisacharydów. Czułość tej metody znacznie przewyższa barwienie bromkiem etydyny i pozwala na detekcję DNA w ilościach rzędu 1-10 pg/mm kw. Barwienie srebrem jest techniką fotochemiczną, podobną do wykorzystywanej w fotografii.
Metoda ta może być nieznacznie modyfikowana w sytuacjach, kiedy wybarwiane są różne związki, należy jednak pamiętać, że schemat postępowania pozostaje niezmienny.
Barwienie srebrem rozpoczynamy od zabiegu utrwalania, polegającego na odwodnienie żelu oraz utrwalenie w nim helisy DNA. Odwodnienie żelu powoduje wzrost jego reaktywności na działanie kolejnych odczynników, natomiast utrwalenie DNA zabezpiecza go przed wypłukiwaniem w dalszych etapach procesu. Utrwalanie przeprowadzamy stosując roztwory odwadniające, którymi najczęściej są alkohole: etanol oraz metanol (może być dodatek kwasu octowego).
W przypadku zastosowania mocznika jako czynnika denaturującego, należy go usunąć z żelu przed procesem utrwalania. Dokładne wypłukanie mocznika zapobiegnie jego związaniu ze srebrem, do którego ma bardzo silne powinowactwo.
W kolejnym etapie przeprowadzamy reakcje utleniania DNA kwasem azotowym, dzięki czemu nić DNA łatwiej zwiąże się z naszym barwnikiem. Jednocześnie redukujemy barwnik (rozpuszczalna sól azotanu srebra) do formy metalicznej używając formaldehydu. Zredukowane do formy metalicznej srebro wiąże się z DNA, tworząc nierozpuszczalne sole. Po tych zabiegach dokładnie opłukujemy żel z pozostałości niezwiązanego srebra, które podczas wywoływania daje silne tło.
Następnym krokiem jest proces wywoływania. W trakcie tego zabiegu przeprowadzamy dalszą redukcję srebra (formaldehydem, węglanem sodowym lub tiosiarczanem sodu). Zredukowane srebro przybiera kolor brązowy, stąd też w miejscach związania srebra z DNA uwidaczniają się brązowe prążki. Wywoływanie przeprowadzamy stopniowo, aż do uzyskania pożądanych efektów. Dodając do pojemnika kwas octowy obniżamy pH roztworu, a tym samym zatrzymujemy proces redukcji. Jednocześnie następuje utrwalenie reakcji barwnej.


O czym należy pamiętać przy metodzie barwienia srebrem?


- Duża wrażliwość metody na zanieczyszczenia nieorganiczne wymaga użycia wody dejonizowanej na wszystkich etapach barwienia, w przeciwnym wypadku możemy spodziewać się silnego tła.

- Barwienie srebrem jest ograniczone do żeli poliakryloamidowych, gdyż w żelach agarozowych czułość metody jest dużo niższa.

- W przypadku detekcji mutacji miejscowo specyficznych (np. mutacje w guzach nowotworowych), a więc w sytuacjach ograniczonej ilości materiału do analizy, barwienie srebrem może okazać się niewystarczające.


Źródła:
Darzynkiewicz Z., Li X., Bedner E. Detection of DNA strand breakage in analysis of apoptosis and cell proliferation by flow and laser scanning cytometry. In: Methods in Molecular Biology. Vol 113.
Noatyńska A. Oranż akrydyny - barwnik o dwóch obliczach. (http://bioinfo.mol.uj.edu.pl/articles/Naotynska03)
Przykłady analiz DNA. Praca zbiorowa pod redakcją Ryszarda Słomskiego, Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu 2004.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

213 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 
 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u