Rys. 1. Struktura polimerazy DNA

Polimerazy DNA są enzymami katalizującymi syntezę DNA. W komórce pełnią istotną rolę np. podczas replikacji. Substratami niezbędnymi do działania polimeraz są nukleotydy (w PCR: dNTP). Synteza DNA odbywa się na matrycy, którą jest jednoniciowa cząsteczka DNA. Synteza ta odbywa się od krótkiego, komplementarnego odcinka DNA zwanego starterem (określany też jako primer).

DNA Polimeraza I - polimeraza Kornberga

Enzym ten otrzymano z E.coli. Jest to pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 109 kD

Aktywności Polimerazy Kornberga:
- synteza DNA od końca 5’ do 3’ - wymaga jednoniciowej matrycy oraz startera DNA lub RNA
- egzonukleaza 3’-5’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA
- egzonukleaza 5’-3’- degraduje dwuniciowy DNA lub hybrydy DNA-RNA

Warunki reakcji:
- pH – około 7,4
- niezbędna obecność jonów magnezowych
- 10x stężony bufor o składzie: Tris-HCl, MgCl2, DTT, BSA

DNA Polimeraza I - fragment Klenowa

Enzym ten uzyskuje się na dwa sposoby: poprzez proteolizę polimerazy Kornberga subtilizyną lub z rekombinantów E.coli. Jest to pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 75 kD

Aktywności DNA Polimerazy I (fragment Klenowa):
- synteza DNA od końca 5’ do 3’ - wymaga jednoniciowej matrycy oraz primera DNA lub RNA
- egzonukleaza 3’-5’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA
- brak aktywności egzonukleazy 5’-3’

Warunki reakcji:
- pH – około 7,4
- niezbędna obecność jonów magnezowych
- reakcja w temperaturze pokojowej do 37 stopni C
- 10x stężony bufor o składzie: Tris-HCl, MgCl2, DTT, BSA

DNA Polimeraza I (fragment Klenowa) charakteryzuje się tym, że bardzo często dodaje jeden lub więcej nukleotydów do końca 3’.

Polimeraza Taq

Enzym ten uzyskano z bakterii Thermus aquaticus lub rekombinantów E.coli. Charakterystyczną właściwością tego enzymu jest termostabilnośc w zakresie temperatur 37-94 stopnie C.

Aktywności Polimerazy Taq:
- synteza DNA od końca 5’ do 3’ - wymaga jednoniciowej matrycy oraz startera DNA lub RNA
- egzonukleaza 3’-5’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA
- brak aktywności egzonukleazy 5’-3’

Warunki reakcji:
- pH – około 7,4
- niezbędna obecność jonów magnezowych
- optimum działania przy 80 stopniach C

Polimeraza Taq dodaje jedną adeninę do końca 3’. Charakterystyczne jest również to, że enzym ten popełnia dużo błędów.

Polimeraza faga T4

Enzym ten uzyskano z bakterii E. coli zakażonych fagiem T4 lub z rekombinantów E. coli. Jest to pojedynczy polipeptyd o masie cząsteczkowej 114 kD

Aktywności Polimerazy faga T4:
- synteza DNA od końca 5’ do 3’ - wymaga jednoniciowej matrycy oraz startera DNA lub RNA
- egzonukleaza 3’-5’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA, większa aktywnośc dla nici pojedynczej niż podwójnej
- brak aktywności egzonukleazy 5’-3’

Warunki reakcji:
- pH – około 8,0-9,0
- niezbędna obecność jonów magnezowych (optymalnie 6 mM)
- optimum działania przy 37 stopniach C
- 10x stężony bufor o składzie: Tris-octan, octan magnezu, DTT, octan potasu, BSA.

Polimeraza faga T7

Enzym ten uzyskano z bakterii E. coli zakażonych fagiem T7. Jest to dimer złożony z produktu genu 5 faga T7 o masie84 kD (aktywnośc polimerazy i egzonukleazy) i trioredoksyny E. coli o masie12 kD (wiązanie z matrycą DNA).

Aktywności Polimerazy faga T4:
- synteza DNA od końca 5’ do 3’ - wymaga jednoniciowej matrycy oraz startera DNA lub RNA
- egzonukleaza 3’-5’ – degraduje jednoniciowy lub dwuniciowy DNA, aktywnośc 1000x większa niż DNA Polimeraza I (fragment Klenowa)!
- brak aktywności egzonukleazy 5’-3’

Warunki reakcji:
- pH – około 7,5
- niezbędna obecność jonów magnezowych
- optimum działania przy 37 stopniach C
- 10x stężony bufor o składzie: Tris-HCl, MgCl2, DTT