biotechnologia


 
 

Regulacja ekspresji genów - siRNA

Ekspresja genów jest złożonym procesem regulowanym m.in przez mechanizm określany jako interferencja RNA (RNAi). Kluczowym składnikiem tego układu regulacyjnego jest dwuniciowy RNA (dsRNA), powodujący degradację homologicznych cząsteczek RNA. Ogół procesów komórkowych, prowadzących ostatecznie do wspomnianej degradacji RNA, określa się jako interferencję RNA. RNAi jest składową ogółu procesów posttranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów, który pierwotnie odkryto u roślin. Wprowadzenie dodatkowych kopii genów syntazy chalkonowej w celu zwiększenia ilości pigmentu w kwiatach petunii wbrew oczekiwaniom spowodowało, iż kwiaty tej rośliny były częściowo lub całkowicie pozbawione zabarwienia. W istocie nie nastąpiła ekspresja dodatkowo wprowadzonego genu, a supresja endogennego genu wytwarzającego pigment. Było to jedno z pierwszych doświadczeń wskazujących na istnienie zjawiska wyciszania ekspresji genów.


Cząsteczki RNA indukujące mechanizmy RNAi charakteryzują się specyficzną strukturą oraz specyficznymi właściwościami chemicznymi. Natywne siRNA, będące produktami nukleolitycznej degradacji długiego dsRNA przez rybonukleazę DICER, mają charakterystyczną budowę. Obie nici RNA o długości 21-23 nukleotydów, tworzą dupleks na odcinku 19 nukleotydów, pozostawiając na każdym końcu 3’ po dwa lub więcej niesparowane nukleotydy. Antysensowna nić siRNA tworzy komplementarny dupleks z docelowym mRNA. Modyfikacje w obrębie tej nici siRNA powodują obniżenie wydajności procesu RNAi lub też całkowity zanik tego zjawiska. siRNA posiadają na końcach 3’ wolną grupę hydroksylową, a na końcach 5’ grupę fosforanową. Wprowadzenie modyfikacji końca 5’ przez przyłączenie grupy 3-aminopropylofosforanowej lub grupy O-metylowej nie ogranicza efektywności procesu RNAi, jeśli modyfikacja dotyczy nici sensownej, natomiast modyfikacja nici antysensownej prowadzi do zaniku procesu RNAi. Wskazuje to, że koniec 5’ nici antysensownej siRNA pełni istotną funkcję w procesie RNAi. Sugeruje się, że miejsce hydrolizy mRNA jest zależne od położenia końca 5’ nici antysensownej siRNA, a 5’-terminalna grupa fosforanowa jest „molekularnym punktem odniesienia”, od którego mierzone jest miejsce hydrolizy mRNA (Tuschl i wsp.). Podstawienie 3’-terminalnej grupy hydroksylowej nici sensownej i antysensownej siRNA resztą fluoresceiny, puromycyny czy biotyną, lub też wprowadzenie 3’-terminalnego 2’,3’-dideoksynukleotydu lub grupy 3-aminopropylofosforanowej nie powoduje zahamowania efektu RNAi. Natomiast modyfikacja nici sensownej za pomocą 2’-O,4-C-etyleno-tymidyny i 2-hydroksy-etylofosforanu tymidyny nie wpływa na jakość RNAi, zaś modyfikacja tymi samymi czynnikami nici antysensownej lub obydwu nici powoduje całkowite zahamowanie RNAi.

Zaproponowano co najmniej dwa mechanizmy, według których może zachodzić proces wyciszania ekspresji genów. W pierwszym z nich inicjacja RNAi następuje przez konwersję dwuniciowego RNA do 21-23-nukleotydowych fragmentów za pomocą wielodomenowej rybonukleazy DICER, wywodzącej się z rodziny RNazy III. Produkty hydrolizy – krótkie dupleksy RNA, zwane siRNA, włączone są w kompleks nukleazowy RISC i kierują go do docelowej sekwencji mRNA. Endorybonukleaza obecna w kompleksie RISC wykorzystuje antysensowną nić siRNA do odnalezienia i degradacji komplementarnej sekwencji mRNA, dlatego też siRNA nazywany jest dupleksem kierującym. Nukleolityczne właściwości kompleksu RISC są istotą procesu RNAi. Przyłączenie siRNA aktywuje RISC, który następnie rozpoznaje i degraduje komplementarny mRNA - blokowana jest w ten sposób ekspresja genu. Drugi mechanizm RNAi, zaproponowany przez Lipardi i wsp., Sijen i wsp., Nishikura i wsp., polega na tzw. „degradacyjnym PCR”. W mechanizmie tym próbuje się wytłumaczyć katalityczny charakter RNAi u nicienia Caenorhabditis elegans. Stwierdzono, że jedynie kilka cząsteczek dsRNA wystarcza do degradacji mRNA. Inaktywacja ekspresji danego genu u tego nicienia utrzymuje się podczas podziałów komórkowych, przenoszona jest do nietransfekowanych komórek i tkanek, jak również pojawia się w następnym pokoleniu. Polimeraza RNA zależna od RNA (RdRP) na matrycy mRNA syntetyzuje nić komplementarną, tworząc nowy dwuniciowy RNA, rozpoznawany i hydrolizowany przez rybonukleazę DICER. W ten sposób tworzona jest nowa generacja siRNA. Starterem w reakcji polimeryzacji jest antysensowna nić siRNA. W reakcji tej szczególne znaczenie ma grupa hydroksylowa obecna na końcu 3’ nici antysensownej siRNA.

Obniżenie poziomu białka wywołane przez egzogenne podanie siRNA jest przejściowe, trwa zwykle 5-7 dni po transfekcji. Podanie plazmidów i wywołanie ekspresji RNA wewnątrz komórki powoduje dłuższy efekt wyciszania. Możliwość stabilnej ekspresji siRNA otwiera drogę do zastosowania zjawiska RNAi w terapii genowej, na przykład w leczeniu infekcji wirusowych. Wysoki koszt syntezy chemicznej RNA bez gwarancji, że wybrane sekwencje wywołają wydajne wyciszenie ekspresji docelowego genu, powoduje, że poszukuje się alternatywnych sposobów uzyskiwania siRNA. Jedną z metod syntezy dużej liczby transkryptów krótkich interferujących RNA jest metoda z udziałem polimerazy RNA z faga T7 (Donze i wsp.). Otrzymywane w ten sposób siRNA wywołują efekt wyciszenia genów egzo- i endogennych w różnych komórkach ssaków. Nici RNA, sensowną i antysensowną, o długości 21 nukleotydów każda, generowano w osobnych reakcjach polimeryzacji na matrycy DNA kodującego wybrany fragment danego genu. Tą metodą otrzymano RNA o strukturze typu spinki (shRNA), o długościach dupleksu 22-29 nukleotydów, z czteronukleotydową pętlą UUAA. Uzyskane transkrypty shRNA wprowadzano do komórek owadów i ssaków. Wykazano, że shRNA w cytoplazmie hydrolizowane są przez enzym DICER do postaci 22-nukleotydowych siRNA, wywołując degradację docelowego mRNA (Paddison i wsp.). Inną metodą uzyskiwania siRNA w warunkach in vitro jest metoda z wykorzystaniem RNazy III z E.coli. Powstałe w wyniku jej działania krótkie fragmenty (e-siRNA) mają taką samą strukturę jak natywne siRNA. Kontrolowana reakcja enzymatycznej hydrolizy prowadzi do wydajnego generowania siRNA o długości 20-25 nukleotydów. e-siRNA wytwarzane w ten sposób wydajnie obniżają ekspresję egzogennych i endogennych genów w różnych liniach komórkowych.


Planowanie sekwencji siRNA, które mogą interferować z ekspresją wybranego genu wymaga wiedzy na temat sekwencji kodującego mRNA. RNAi jest procesem cytoplazmatycznym, dlatego też siRNA nie może być skierowane na sekwencje intronowe pre-mRNA, którego dojrzewanie zachodzi w jądrze. Musi być skierowane na sekwencje kodujące genu. siRNA o sekwencjach homologicznych do różnych miejsc mRNA tego samego genu, mogą indukować zróżnicowany poziom ekspresji genu. Selekcja sekwencji docelowej dokonywana jest doświadczalnie metodą prób i błędów. Najlepiej wybierać sekwencję odległą o 50-100 nukleotydów od miejsca inicjacji translacji. Najlepiej jest wybierać sekwencje siRNA posiadające na końcach 3’ reszty urydylowe. Zawartość G-C w projektowanych sekwencjach nie powinna przekraczać 30-40%. Należy unikać sekwencji bogatych w G zdolnych do tworzenia struktur tetrapleksowych. Zjawisko RNAi odgrywa bardzo ważną rolę w prawidłowym funkcjonowaniu komórki i całego organizmu. Zaburzenia tego procesu powodują szereg niekorzystnych zmian w organizmie. Indukowany RNAi stanowi obronę przed wirusami, ochronę genomu przed transpozonami oraz współuczestniczy w regulacji ontogenezy. RNAi wpływa na stabilność genomu poprzez ograniczenie integracji transpozonów, które wbudowując się mogą przerwać ciągłość genów. Inhibicja ekspresji genów poprzez RNAi może przebiegać na różnych poziomach. dsRNA u roślin indukuję metylację fragmentów genomu, a w przypadku modyfikacji sekwencji promotora następuje zablokowanie transkrypcji genu. RNAi może także modulować strukturę chromatyny. Opisano pierwsze udane eksperymenty wykorzystujące siRNA skierowane przeciwko genom białek rev i tat w liniach komórkowych transfekowanych prowirusem HIV-1, jak również genom receptora komórkowego cd4, białka strukturalnego gag czy białka regulatorowego nef. Działania anty-HIV mają także na celu hamowanie replikacji wirusa w komórkach gospodarza. Po zastosowaniu siRNA w limfocytach zaobserwowano obniżenie poziomu wirusa HIV w komórkach do 30-50 razy. Inhibicja infekcji wirusowej przez RNAi dotyczy także innych wirusów jak: RSV, który wywołuje szereg chorób układu oddechowego oraz wirusa polio. Ekspresja siRNA w wektorach retrowirusowych pozwala na kierowanie ich do komórek pierwotnych, co do tej pory było nieosiągalne. Wysoka specyficzność siRNA stwarza nadzieję ich zastosowania do wyciszania onkogenów. RNAi wykorzystuje się również jako narzędzie do badania własności genów u różnych organizmów poprzez „knock-out” mRNA i obserwacje funkcjonalnego efektu inhibicji ekspresji całych grup genów na poziomie komórki czy całego organizmu.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

214 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u