Green fluorescent protein – czyli GFP, jest białkiem pochodzącym z meduzy Aquorea victoria. Za jego odkrycie Chalfie, Shimomura i Tsien otrzymali nagrodę Nobla w 2008 roku. GFP świeci na zielono w ultrafiolecie. Złożone jest z 238 aminokwasów a jego masa wynosi 26,9 kDa. To białko ma strukturę ß – baryłki, składającej się z jednej ß – kartki z α – helisami zawartymi w chromoforze, biegnącymi przez centrum. Łańcuchy boczne białka tej baryłki indukują specyficzną cyklizację reakcji w tripeptydzie Ser65 -Tyr66 – gly67, która prowadzi do powstania chromoforu. Ten proces posttranslacyjnej modyfikacji jest opisywany jako dojrzewanie.
FP mogą występować w różnych wariantach barwnych, np. żółtym – YFP (ang. yellow fluorescent protein), tj. Citrine, Venus i YPet, niebieskim – BFP (ang. blue fluorescent protein), tj. Azurite, mKalama 1, EBFP (ang. enhanced blue fluorescent protein – białko o wzmocnionej fluorescencji) i EBFP 2 a także RFP (ang. red fluorescent protein). Nomenklatura modyfikowanych GFP jest często zbieżna z powodu mapowania kilku wersji GFP do pojedynczej nazwy. Wersja GFP wrażliwa na redox (roGFP) była zmieniona poprzez wprowadzenie cysteiny do struktury ß – baryłki. Stan redox cystein determinuje fluorescencyjne właściwości roGTP. Mutanty GFP cechują się szybszym czasem dojrzewania fluoroforu, większą stabilnością i emisją silniejszego sygnału świetlnego niż formy dzikie. Te warianty GFP, które służyły do badania aktywności i funkcjonalności promotorów, charakteryzowały się krótszym okresem półtrwania.
Ze względu na niską toksyczność GFP jest może być szeroko stosowane. Pozwala to na detekcję odbywającą się bez niszczenia struktur mikroorganizmów oraz wykrywanie znaczonych komórek bez ich wcześniejszego wybarwienia. W odróżnieniu od innych białek wykazujących fluorescencję nie wymaga ono kofaktorów (jako aktywatorów) ani towarzyszących białek oraz ATP (jak lucyferaza). Do wzbudzenia jego fluorescencji wymagane jest jedynie światło mieszczące się w zakresie absorbancji, a do wzbudzania wystarczą dwa kwanty światła.
Produkt genu GFP jest włączany do genomu organizmu w rejon DNA, który koduje docelowe białko i jest kontrolowane przez tę samą regulatorową sekwencję. W komórkach, gdzie następuje ekspresja genów i są produkowane białka, GFP jest wytwarzany w tym samym czasie. Analiza czasu wygaśnięcia tego białka jest używana do zrozumienia wielu z biologicznych procesów, do których zalicza się fałdowanie białek, transport białek oraz dynamikę RNA. GFP umożliwia optyczną detekcję specyficznego typu komórek in vitro lub nawet in vivo (w żywych organizmach). Kilka spektralnych wariantów GFP modyfikowanych genetycznie jest przydatnych w analizowaniu położenia neuronów (mapowania mózgu) w Brainbow. Innym ciekawym zastosowaniem fluoryzujących białek jest użycie FP jako sensora neuronalnego potencjału błonowego, śledzenie receptorów AMPA w błonie komórkowej oraz badanie infekcji poszczególnymi wirusami grypy. Stworzono także nowe transgeniczne GFP, które mogą mieć istotne znaczenie dla terapii genowej. W biologii molekularnej GFP jest często wykorzystywane do wizualizacji np. lokalizacji białek w komórce przez utworzenie fuzji danego białka z GFP. Doskonale sprawdza się też jako cząsteczka reporterowa, służąca do badania m. in. aktywności promotorów lub wydajności transfekcji komórek. Ponadto plusem jest stabilność sygnału – GFP jest odporne na denaturację termiczną i utrzymuje fluorescencję do temperatury ok. 65ºC. Odporne jest również na denaturację chemiczną, gdyż wykazuje fluorescencję w zakresie pH od 6 do 12. Ze względu na zwartą strukturę nie ulega działaniu wielu enzymów proteolitycznych tj. trypsyny i papainy, aż do stężenia 1 mg/ml. To białko ma minimalny wpływ na dynamikę procesów zachodzących na powierzchni komórek ze względu na ekspresję zachodzącą w cytoplazmie. Jest ono ciągle syntetyzowane w komórkach, jedynie podczas replikacji u bakterii następuje minimalne obniżenie sygnału fluorescencji. Brak jest również tła emitowanego przez autochtoniczne populacje bakteryjne, które zakłócałoby detekcję.
Jedynym ograniczeniem w aplikacji genu gfp jest dostępność tlenu, ponieważ w warunkach beztlenowych nie dochodzi do prawidłowego formowania się odpowiedzialnego za świecenie fluoroforu. W konsekwencji następuje zmiana długości fali maksymalnego wzbudzenia oraz emisji. Do wad GFP należy również m. in. niestabilność plazmidów zawierających geny kodujące GFP – bardziej stabilne są inserty wprowadzone w chromosom bakteryjny, co pozwala na obniżenie ryzyka transferu genu kodującego GFP do genomów bakterii autochtonicznych. Ponadto w warunkach beztlenowych GFP nie emituje sygnału. Niezbadana jest zmienność ekspresji GFP w komórkach różnych gatunków oraz wpływ czynników środowiskowych na ekspresję GFP.
Reasumując, GFP jest jednym z najbardziej popularnych genów reporterowych w biologii molekularnej, dzięki możliwości przyżyciowego monitorowania in situ horyzontalnego transferu genów między mikroorganizmami, ich aktywności w różnych środowiskach oraz monitorowaniu poziomu ekspresji genów. Ekspresję genu gfp wykazano z użyciem wektorów plazmidowych jak i transpozonów. Fuzje badanych białek z GFP pozwalają na monitorowanie w czasie rzeczywistym migracji białek fuzyjnych w różnych układach i kompleksach wielobiałkowych. Właściwości fizykochemiczne tego białka wynikają bezpośrednio z kolejności i typu aminokwasów. Ewolucja faworyzowała trwałość GFP i ochronę centralnie położonego fluoroforu przed wygaszeniem.
Autor: Wioleta Aneta Dołowa, Biotechnologia, Uniwersytet Warszawski
Bibliografia:
1).Matejczyk, M., Rosochacki, S., J., Gen gfp jako fluorescencyjne narzędzie w analizie ekspresji genów i konstrukcji biosensorów, Prace przeglądowe
2).Ormö, M., Cubitt, A., Kallio, K., Gross, L., Tsien, R., Remington, S., 1996, Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein, FEBS Lett 341 (2 – 3): 277 – 80.
3).Remy, S., Tesson, L., Vsal, C., Menoret, S., Bonnamain, V., Nerriere – Daguin, V., Rossingol, J., Boyer, C., Nguyen, T., H., Naveilhan, P., Lescandron, L., Anegon, I., 2010, New line of GFP transgenic rats relevant for regenerative medicine and gene therapy, Transgenic Res 19 (5): 745 – 63.
