Autor artykułu: Marcin Pastwa
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych jest zjawiskiem związanym ze spontanicznym łączeniem się komplementarnych odcinków nici DNA ze sobą. Pod wpływem wysokiej temperatury lub substancji chemicznych tj. formamid, następuje rozdzielenie (denaturacja) podwójnej helisy DNA, lub RNA. Gdy wyeliminujemy czynnik denaturujący nastąpi odwrócenie procesu (renaturacja), czyli ponowne tworzenie podwójnej helisy. Wprowadzając do mieszaniny kwasów nukleinowych obce DNA lub RNA, w wyniku renaturacji, oprócz wyjściowych cząsteczek uzyskamy cząsteczki hybrydowe.
Szybkość procesu zależy od kilku czynników, do których należą m.in.: długość hybrydyzujących fragmentów, komplementarność sekwencji oraz obecność substancji hamujących proces hybrydyzacji. Stosowanie sond jednoniciowych wiąże się z ryzykiem ich degradacji przez RNazy. Problem ten nie występuje w przypadku zastosowania sond dwuniciowych.
Metody hybrydyzacji molekularnej:
-Southern Blotting,
-DNA fingerprinting,
-Northern blotting,
-In situ hybridization (FISH).
FISH – istota procesu
FISH (ang. fluorescence in situ hybridization) jest techniką cytochemiczną polegającą na hybrydyzacji sekwencji DNA lub RNA ze specyficznymi sondami znakowanymi barwnikami fluorescencyjnymi. Dzięki reakcji sonda–nić DNA jesteśmy w stanie określić pozycję markera, czyli specyficznej, zazwyczaj oligonukleotydowej sekwencji, na badanej nici DNA. Stosując technikę FISH możemy również zidentyfikować interesujący nas chromosom (np. chromosom X lub Y – wykorzystanie FISH w badaniach przebiegu mejozy u zwierząt). Określenie in situ wskazuje na miejsce przeprowadzania reakcji hybrydyzacji, którym jest naturalne środowisko występowania DNA (chromosomy, komórki).
Obserwacja zhybrydyzowanej sondy z komplementarną sekwencją DNA, jest możliwa dzięki wyznakowaniu sondy fluorochromem, który pod wpływem wzbudzenia światłem (UV-VIS) emituje promieniowanie (świeci). Do analizy badanego materiału wymagany jest mikroskop fluorescencyjny.
Mikroskop fluorescencyjny
Utrwalanie i hybrydyzacja
Przygotowanie komórek do doświadczenia polega na usunięciu cytoplazmy i utrwaleniu jąder komórkowych na szkiełku podstawowym (hybrydyzacja na poziomie DNA jądrowego) lub odpowiednie utrwalenie całych komórek (hybrydyzacja sond z mRNA występującym w cytoplazmie).
Doświadczenie wykonuje się na skrawkach kriostatowych lub parafinowych oraz hodowlach komórek w monowarstwie. Prowadzone są także badania na skrawkach z materiału formalinowego. Przygotowane próby mogą być użyte bezpośrednio po utrwaleniu, lub przechowywane w roztworze soli fizjologicznej (opcjonalnie etanolu), w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
– hybrydyzacja z RNA
Dzięki odpowiedniemu przygotowaniu komórek możemy uniknąć niespecyficznych absorpcji sondy do elementów komórkowych, oraz łatwiejszą penetrację cytoplazmy komórek. Skrawki poddajemy działaniu bezwodnika octowego, detergentu oraz 0,01 do 0,1 M HCL, których zadaniem jest zobojętnienie białek zasadowych, nieswoiście wiążących kwasy nukleinowe. W przypadku plemników czy błony śluzowej żołądka, zabiegi te są niewystarczające, toteż dodatkowo traktujemy je proteinazami (np. proteinazą K).
Pracując nad wykrywaniem RNA sondami jednoniciowymi przykładamy dużą uwagę do czystości preparatów, gdyż niekontrolowane pojawienie się RNaz może zniszczyć cały wkład naszej pracy (RNazy występują np. w pocie). Problem ten nie istnieje, gdy wykrywamy DNA na poziomie jądra komórkowego lub chromosomów używając do tego celu sond dwuniciowych (dsDNA).
W celu uniknięcia degradacji przez RNazy sond jednoniciowych, hybrydyzujących z RNA, stosuje się sondy dwuniciowe.
– hybrydyzacja z DNA
Całość zabiegów niewiele różni się od tych opisanych powyżej. W sytuacji, kiedy planujemy otrzymać hybrydy na poziomie jądra, musimy pozbyć się środowiska, które go otacza. Jest to istotne szczególnie wtedy, gdy naszym celem jest wybarwienie chromosomów, oraz uzyskanie wysokiej rozdzielczości obrazu. W innym przypadku, gdy chcemy wybarwić określone chromosomy aby zidentyfikować ich położenia w komórce, postępujemy jak w przypadku hybrydyzacji RNA (nie usuwamy struktur komórkowych).
Niewątpliwą różnicą pomiędzy hybrydyzacją DNA i RNA jest to, że w przypadku pierwszej, konieczna jest denaturacja nici tuż przed połączeniem z sondą. Również zastosowane sondy dwuniciowe wymagają rozbicia na dwie oddzielne nici. Brak denaturacji uniemożliwia połączenie sondy z komplementarnym odcinkiem kwasu nukleinowego.
Aby denaturować bez konieczności niszczenia morfologii chromosomów suszymy je na szkiełku podstawowym, a następnie poddajemy działaniu formamidem. Inne utrwalacze stosowane w hybrydyzacji in situ także pozwalają uzyskać pozytywne efekty. Mogą to być utrwalacze precypitacyjne oparte na alkoholu, czy utrwalacze wiążące krzyżowo takie jak: formalina, paraformaldehyd czy aldehyd glutarowy. Ten ostatni może utrudniać penetrację sondy poprzez silne usieciowanie białek cytoplazmy – mówimy tu o sytuacji, gdy nie wyodrębniamy jądra ze struktur komórkowych.
Wymaga się, aby stosowane odczynniki z jednej strony zachowywały badane kwasy nukleinowe w komórce, z drugiej zaś nie utrudniały penetracji przez sondy wewnątrz cytoplazmy. Dokonując wyboru utrwalacza zwracamy uwagę na rodzaj kwasów nukleinowych oraz sondy z uwzględnieniem jej masy cząsteczkowej.
Po wykonaniu czynności wstępnych nanosimy na preparat sondę wyznakowaną fluorescencyjnie i poddajemy kilkugodzinnej hybrydyzacji (RNA, DNA), pamiętając o konieczności wcześniejszej denaturacji (DNA, sondy dwuniciowe, dsRNA).
Dla uniknięcia szybkiej renaturacji, zdenaturowaną nić DNA przenosimy do strefy niskiej temperatury (np. łaźnia lodowa). Zabieg ten nie jest konieczny, gdy inkubacja DNA z sondą w ośrodku denaturującym przebiega równocześnie (krótkotrwała denaturacja 2-3 min, w temp. 95 stopni Celsjusza w obecności formamidu).
– usuwanie niezwiązanych sond
Po etapie hybrydyzacji usuwamy nadmiar niezwiązanych sond kilkukrotnie opłukując preparat w odpowiednim buforze (wg określonej metodyki). Zaleca się płukanie w roztworze o tej samej temperaturze w jakiej zachodziła hybrydyzacja. Płukanie można przeprowadzać w obecności skrawków nitrocelulozowych, które będą absorbować niezwiązane sondy. Uwidocznienie jąder komórkowych następuje po wybarwieniu barwnikiem specyficznym dla DNA (np. DAPI – 4,6-diamidyno-2-phenylindol). Obserwacji preparatu dokonujemy pod mikroskopem fluorescencyjnym.
– prehybrydyzcja
Właściwa hybrydyzacja powinna być poprzedzona prehybrydyzacją. Polega to na inkubacji sondy w mieszaninie zawierającej nieoznaczony DNA. Pozwala to zredukować niespecyficzność hybrydyzacji będącej wynikiem istnienia na sondzie sekwencji powtórzonych. Sytuacja ta może zaistnieć gdy zastosujemy długie sondy, szczególnie u organizmów eukariotycznych. Istnieje wówczas prawdopodobieństwo wystąpienia hybrydyzacji niespecyficznych w miejscach występowania powtarzalnych sekwencji.
Modyfikacje techniki FISH
Modyfikacją techniki FISH jest M-FISH (ang. multiplex fluorescence in situ hybridization). W przypadku pierwszej stosujemy jedną sondę znakowaną fluorescencyjnie, z kolei w drugiej używamy kilku sond znakowanych różnymi fluorochromami, które po wzbudzeniu dają różnobarwny obraz wyznakowanych chromosomów.
Odmianą M-FISH jest technika molekularnego kariotypowania – analiza widmowa kariotypu SKY (ang. spectral karyotyping). Polega na wybarwianiu określonych regionów chromosomu przy użyciu komplementarnych sond molekularnych, wyznakowanych różnymi fluorochromami. W rezultacie otrzymujemy wielobarwny obraz kariotypu, gdzie każda para chromosomów ma inny kolor.
Fluorescencyjne sondy wykorzystywane w FISH
Dylematy związane ze stosowaniem sond znakowanych izotopami (patrz: znakowanie sond izotopami) doprowadziło do wytworzenia szeregu znaczników fluorescencyjnych, które charakteryzują się wysoką czułością oraz rozdzielczością (stąd nazwa techniki FISH).
Sondy stosowane w technice FISH dzielimy na:
– malujące (wcp – ang. whole chromosome paint)
– pokrywające chromosom lub poszczególne ramiona
– alfa-satelitarne (centromerowe, telomerowe)
– specyficzne dla poszczególnych sekwencji lub określonego locus
Wśród znaczników fluorescencyjnych, używanych do znakowania sond wymienić należy:
rodaminę, fluoresceinę oraz kumarynę.
Znakowanie sond izotopami
Początkowe znakowanie sond izotopami promieniotwórczymi okazało się niezbyt dobrym rozwiązaniem. Wymagania jakie stawia technika hybrydyzacji in situ, czyli uzyskanie wysokiej czułości i rozdzielczości obrazu, w przypadku izotopów, były trudne do spełnienia. Uzyskanie wysokiej czułości przy znakowaniu promieniotwórczym wymaga zastosowania znacznika emitującego dużą energię, która z kolei jest przyczyną rozpraszania sygnału. W efekcie uzyskuje się obraz o słabej rozdzielczości. Izotopy a niskiej energii emisji pozwalają uzyskiwać wysokie rozdzielczości, jednak charakteryzują się stosunkowo małą czułością. Przedłużanie ekspozycji, w celu poprawy czułości jest przyczyną powstawania silnego tła.
Do innych wad sond znakowanych radioaktywnie zaliczyć należy względy zdrowotne i środowiskowe, stąd też znaczniki te coraz bardziej tracą na popularności.
Radioizotopy:
Tryt, Czas półtrwania: 12,35 lat, Energia emitowanych cząstek (MeV): 0,0186;
Węgiel-14, Czas półtrwania: 5730 lat, Energia emitowanych cząstek (MeV): 0,156;
Siarka-35, Czas półtrwania: 87,5 dnia, Energia emitowanych cząstek (MeV): 0,167;
Fosfor-33, Czas półtrwania: 25,5 dnia, Energia emitowanych cząstek (MeV): 0,248;
Fosfor-32, Czas półtrwania: 14,3, Energia emitowanych cząstek (MeV): 1,709;
P32 – fosfor radioaktywny, stosowany do znakowania DNA i RNA
S35 – izotop siarki, głównie DNA
H3 – tryt – znakowanie DNA (głownie)
FISH – zastosowanie w diagnostyce
Technika FISH znalazła szerokie zastosowanie w badaniach cytogenetycznych. Z najważniejszych wymienić należy: diagnostyka submikroskopowych aberracji chromosomowych, identyfikacja złożonych aberracji struktury chromosomów, identyfikacja dodatkowego materiału chromosomowego, chromosomów markerowych czy diagnostyka aneuploidii chromosomowych.
Najczęściej stosowane badania zespołów lub zaburzeń o podłożu genetycznym takich jak: zespoły Williamsa, Rubinstein-Taybiego, Wolfa-Hirshhorna, Prader-Willego, badanie przyczyn niepełnosprawności umysłowej powodowej w 50 procentach wadami genetycznymi, ponadto zaburzenia różnicowania płciowego (obojnactwo).
Technika FISH umożliwia wykrywanie chorób nowotworowych, np. poprzez ocenę liczby kopii danego genu w komórkach nowotworowych. Dzięki niej możemy także identyfikować obecność określonych drobnoustrojów w materiale biologicznym, lub jako metoda skreeningowa zakażenia, służąca szybkiej identyfikacji w materiale biologicznym np. bakterii Achromobacter xylosoxidans czy Alcaligenes faecalis.
FISH obok techniki PCR, jest nieocenioną pomocą w diagnostyce preimplantacyjnej pojedynczej komórki polocytu czy blastomeru, dzięki czemu pozwala uniknąć implantacji in vitro zarodka obarczonego wadami genetycznymi.Literatura:
Fluorescence In Situ Hybridization for Rapid Identification of Achromobacter xylosoxidans and Alcaligenes faecalis Recovered from Cystic Fibrosis Patients” – J Clin Microbiol. 2006 September; 44 (9): 3415–3417.
Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej” – pod redakcją J. Bala, PWN 2008.
Zastosowanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w identyfikacji zmian materiału genetycznego u osób z niepełnosprawnością intelektualnością intelektualną. M. Zając, M. Wiśniewska, Nowiny Lekarskie 2003, 72, 1, 9-13.
M-FISH analysis shows that complex chromosome aberrations induced by α-particle tracks are cumulative products of localized rearrangements” – Rhona M. Anderson, David L. Stevens, and Dudley T. Goodhead, Communicated by Mary F. Lyon, Medical Research Council, Oxon, United Kingdom, 5, 2002 (received for review March 8, 2002).
Immunocytochemia. Praca pod redakcją Macieja Zabla, PWN Warszawa 1990.
