Protoplasty to komórki roślinne pozbawione ściany komórkowej. Po raz pierwszy termin ten został wprowadzony do literatury w roku 1880 przez Hansteina i od tego czasu trwają intensywne badania nad sposobem wykorzystania tych struktur. Obecnie coraz częściej przeprowadza się manipulacje z wykorzystaniem protoplastów roślinnych. Ma to głownie na celu udoskonalenie poszczególnych gatunków roślin poprzez zwiększenie ich produktywności oraz zawartości substancji biologicznie czynnych. Ponadto przeprowadzenie fuzji protoplastów pozwala na na wyhodowanie gatunków roślin wolnych od patogenów wirusowych i bakteryjnych, jak również roślin odpornych na działanie czynników fizycznych i chemicznych. Fuzja protoplastów pozwala na uzyskanie mieszańców roślin, których nie udaje się otrzymać w sposób tradycyjny, przez krzyżowe zapylanie. Dodatkowo, protoplasty mogą być bezpośrednio transformowane genetycznie z użyciem elektroporacji lub glikolu polietylenowego i można z nich wówczas uzyskać rośliny transgeniczne. Dzięki szerokiemu zastosowaniu techniki fuzji protoplastów, która stanowi alternatywę względem metod hodowlanych genetyki klasycznej, możliwe jest uzyskanie szerokiej gamy roślin o nowych pożytecznych cechach.
Izolacja protoplastów
Protoplasty po raz pierwszy zostały wyizolowane w roku 1960 przez Cockinga, który zastosował metodę enzymatycznego trawienia ściany komórkowej. Materiałem wyjściowym z którego otrzymuje się protoplasty mogą być hodowle tkanek in vitro, tkanki z organów roślinnych jak również wyspecjalizowane grupy komórek takie jak: aparaty szparkowe, fragmenty kwiatu, ziarna pyłku, korzenie, pędy. Najczęściej wykorzystywanym źródłem protoplastów jest mezofil. Proces izolacji omawianych struktur przebiega kilkuetapowo. Pierwszym etapem jest sterylizacja materiału wyjściowego. Powszechnie wykorzystywanym środkiem dezynfekcyjnym jest podchloryn sodu lub jego handlowe odpowiedniki. Jeżeli protoplasty izolujemy z organu lub tkanek hodowanych in vitro nie ma konieczności przeprowadzenia dezynfekcji materiału wyjściowego. Kolejnym etapem jest usunięcie ściany komórkowej, która stanowi znaczną barierę w otrzymywaniu roślin transgenicznych. Stosuje są dwie zasadnicze metody usunięcia ściany komórkowej: mechaniczną i trawienia enzymatycznego. Izolacja mechaniczna polega na preplazmolizie komórek w roztworze hipertonicznym wybranego stabilizatora osmotycznego, a następnie na rozdrobnieniu tkanki. W metodzie enzymatycznej, która jest stosowana znacznie częściej, przeprowadza się hydrolizę ściany za pomocą enzymów z grupy celulaz, hemicelulaz i pektynaz. Ostatni etap izolacji protoplastów polega na oczyszczeniu zawiesiny uzyskanej po trawieniu enzymami z niestrawionych fragmentów tkanki, uszkodzonych protoplastów oraz fragmentów komórek. Najczęściej w celu oczyszczenia zawiesiny stosuje się technikę wirowania w gradiencie gęstości.
Metody fuzji protoplastów
W populacji świeżo wyizolowanych protoplastów może dochodzić do ich spontanicznego łączenia się, jednakże ze względu na działanie sił elektrostatycznego odpychania wydajność tego procesu jest bardzo niska. W celu pokonania sił utrudniających wzajemnie łączenie się protoplastów stosuje się fuzję indukowaną chemicznie. W metodzie tej wykorzystuje się surfaktanty (niejonowe środki powierzchniowo czynne) takie jak PEG (glikol polietylenowy), których działanie polega na zmniejszaniu sił odpychania pomiędzy protoplastami poprzez neutralizację ujemnego ładunku powierzchniowego plazmolemy. W efekcie protoplasty mogą się wzajemnie zlepiać, a następnie może dochodzić do wytworzenia integralnych połączeń miedzy błonami zaglutynowanych protoplastów. Ponadto inkubacja protoplastów roślin z plazmidowym DNA przeprowadzana w obecności glikolu polietylenowego (PEG) powoduje obniżenie napięcia powierzchniowego błony komórkowej protoplastu dzięki czemu plazmidowe DNA przenika do wnętrza tych struktur. Kolejną metodą, która prowadzi do połączenia się protoplastów jest elektrofuzja. W wyniku traktowania protoplastów prądem zmiennym i stałym, następuje ustawienie protoplastów wzdłuż linii pola elektrycznego. Protoplasty stykają się bezpośrednio ze sobą tworząc „łańcuchy”. Następnie dochodzi do odwracalnej perforacji błony komórkowej, która umożliwia fuzję błon stykających się ze sobą protoplastów. W wyniku fuzji powstają heterokariony zawierające jądra i cytoplazmy obu partnerów. W przypadku genomu jądrowego po fuzji możemy uzyskać hybrydy symetryczne z pełną zawartością genomów obojga rodziców oraz hybrydy niesymetryczne posiadające niepełny genom jądrowy jednego z rodziców oraz geny plastomu.
Znaczenie fuzji protoplastów
Fuzja protoplastów, pozwala na uzyskanie hybryd somatycznych. Jest to obecnie jedyna z nielicznych metod pozwalających na ominięcie barier pre- i postzygotycznych występujących w procesie seksualnego krzyżowania się roślin. Metoda ta pozwala na otrzymywanie mieszańców pomiędzy odległymi gatunkami a nawet rodzajami roślin co w konsekwencji prowadzi do uzyskania nowych, unikatowych cech, wynikających z oddziaływań pomiędzy wyjściowymi genomami. Jednym z przykładów który obrazuje praktyczne zastosowanie fuzji protoplastów jest hybrydyzacja somatyczna Solanum tuberosum, który jest wrażliwy na wirusa Y i PLRV z opornym, dzikim szczepem Solanum brevidens. W wyniku fuzji uzyskano niewrażliwe, płodne mieszańce.
Beata Rola
Literatura:
1) Ślesak I., 1997. Fuzja protoplastów roślinnych i jej praktyczne znaczenie. Wiadomości botaniczne, 41:63-76
2) Rybczyński J., 2006. Poszerzenie zmienności genetycznej z wykorzystaniem somatycznej hybrydyzacji w obrębie Gramineae. Biotechnologia. 75:136-144
3) Pierik R.. 1997. In vitro Culture of Higher Plants. Martinus Nijhoff Publishers Dordrecht
