Autor: Izabela Podgórska, Uniwersytet Przyrodniczy w Lublinie, kierunek: biotechnologia
Definicja i zasady skriningu
Skrining to zespół selektywnych zabiegów, które mają na celu wykrycie i wyizolowanie spośród dużej liczby drobnoustrojów tylko tych, które odpowiadają konkretnym wymaganiom technologicznym oraz wstępne sprawdzenie ich przydatności do danego procesu.
Jest niezwykle szeroki wybór stosowanych metod podczas poszukiwania użytecznych szczepów i ich produktów. Postęp w poznawaniu mechanizmów licznych procesów biologicznych oraz opanowanie nowych technik badawczych umożliwiają oprzeć skrining drobnoustrojów i wytwarzanych przez nie produktów na bardziej racjonalnych zasadach. W tym zakresie zostały wypracowane i nadal są doskonalone programy badawcze.
W początkowym etapie skriningu niejednokrotnie mamy do czynienia z nieznanym szczepem, który wytwarza nieznane substancje w małych stężeniach. W tym przypadku zasadniczym zadaniem jest wykrycie metabolitów o przypuszczalnym znaczeniu użytkowym [Chmiel, 1998].
Szczepy drobnoustrojów przemysłowych poddawane są zabiegom skriningu w sposób ciągły- podczas ich pozyskiwania ze środowiska, doskonalenia ich cech czy wykorzystania tych szczepów w konkretnych technologiach [Galas i in., 1995].
Ogólna strategia nowoczesnego skriningu:
1. Pozyskiwanie szczepów:
– izolacja drobnoustrojów ze środowiska, eliminacja powtórzeń, klasyfikacja i przechowywanie,
– modyfikacja genotypu w celu pozyskania nadprodukcji metabolitu o odmiennej strukturze lub produkcji całkowicie obcej dla mikroorganizmu struktury chemicznej;
2. Skrining produktów:
– opracowanie metod oraz dokładnie ukierunkowanego skriningu in vitro,
– izolacja i identyfikacja produktu,
– testowanie aktywności in vivo;
3. Optymalizacja produkcji:
– opracowanie podłoża i warunków fizycznych bioprocesu,
– powiększenie skali i wdrażanie przemysłowe,
– prowadzenie i usprawnienie procesu technologicznego [Chmiel, 1998].
Szybkie metody selekcji (skrining) mogą występować w dwóch formach, jako:
– nieselektywne, przypadkowe wyszukiwanie, kiedy każdy z wyizolowanych szczepów jest oddzielnie badany pod względem pozyskania oczekiwanej cechy,
– selektywne lub racjonalne poszukiwanie szczepów [Bednarski, 1993].
Skrining losowy
Skrining losowy jest metodą badań populacji w warunkach typowych dla jej wzrostu i biosyntezy określonego metabolitu. Stosuje się go, kiedy brak jest należnych kryteriów, na podstawie których można w typowy sposób wyróżnić spomiędzy otrzymanych monokultur warianty pozytywne, np. poprzez obserwacje morfologii kolonii. Przykładem tej formy skriningu jest posiew badanej populacji na stałe podłoże, losowe wybranie nie różniących się morfologicznie kolonii, izolowanie ich, a następnie sprawdzanie ich aktywności w próbach fermentacyjnych. Taki losowy wybór kolonii niesie ze sobą ryzyko zatracenia pozytywnych wariantów. W większości przypadków dąży się, aby liczba testowanych monokultur była jak największa, przez co zabiegi te stają się pracochłonne i uciążliwe. Perspektywą usprawnienia tych badań jest zastosowanie odpowiednich substratów czy wskaźników w podłożu testowym, dzięki którym można zaobserwować pojawienie się barwnych stref wokół kolonii o określonej aktywności metabolicznej.
W przypadku, gdy ulepszone warianty nabywa się z niską częstotliwością, a metody badania aktywności klonów są mało precyzyjne, zaleca się prowadzenie tzw. wieloetapowego skriningu (multi-level screening). Polega on na wykonywaniu serii selekcji, przy czym do ponownych zabiegów kierowana jest względnie duża liczba izolatów wybieranych w poprzednich etapach badań. Poszczególne etapy skriningu dążą do eliminacji najsłabszych monokultur, a nie do wyboru najlepszych wariantów [Galas, 1995].
Racjonalny skrining
Dzięki rozwojowi wiedzy, poznaniu szlaków biosyntezy konkretnych produktów i mechanizmów regulacji metabolizmu, stało się możliwe opracowanie bardzo efektywnych, racjonalnych metod skriningu szczepów. Ogromne znaczenie ma postęp w dziedzinie technik badawczych, dających możliwość szybkiej analizy jakościowej i ilościowej wydzielanych bioproduktów, automatyzację i miniaturyzację oznaczeń oraz sterowanie za pomocą mikroprocesów. Racjonalny skrining polega na podobnym działaniu, jak w przypadku losowego skriningu, z tym że prowadzony jest w warunkach, które limitują wzrost niepożądanych kultur lub ograniczają ujawnienie się niekorzystnych cech, przez co ułatwiają selekcję najcenniejszych monokultur [Galas, 1995].
Metody bezpośrednie racjonalnego skriningu bazują na określeniu produktywności szczepu, czyli zasadniczego parametru decydującego o powodzeniu skriningu. W metodzie tej warunki doświadczenia dobiera się jednak tak, aby produktywność była w pewien sposób ograniczona, dając możliwość łatwiejszego wyszukania szczepów o najwyższej aktywności. Najkorzystniej prowadzić tę formę selekcji w warunkach chemostatu, na podłożach zawierających substrat w stężeniu ograniczającym wydzielenie produktu lub z dodatkiem innych substancji wyznaczających proces biosyntezy. Ta forma skriningu może być także stosowana podczas poszukiwań szczepów, które wykorzystują tańsze, mniej oczyszczone surowce odpadowe [Galas, 1995; Fiedurek, 2004].
W metodzie pośredniej racjonalnego skriningu dokonuje się selekcji szczepów w warunkach, które mają na celu wykrycie kolejnych cech wpływających w zasadniczy sposób na wydajność biosyntezy danego produktu. Prowadzi się ją często w warunkach letalnych dla niepożądanych kultur, przez co wzbogaca się populację w mutanty o pozytywnych cechach. Metody pośrednie obarczone są dużym błędem, dlatego wykorzystuje się je do wstępnej selekcji materiału po mutagenizacji, a ocenę wybranych klonów prowadzi się przez określenie poziomu produktywności, bardzo często w warunkach hodowli wgłębnej.
Pośrednie formy racjonalnego skriningu mogą polegać na:
– poszukiwaniu mutantów konstytutywnych,
– obniżeniu stopnia inhibicji produktem końcowym,
– obniżeniu represji katabolicznej,
– wzroście aktywności detoksykacyjnej,
– zwiększeniu oporności w stosunku do toksycznych analogów produktów pośrednich metabolizmu,
– obniżeniu wrażliwości w stosunku do wyznaczonych składników pożywek lub prekursorów,
– selekcji mutantów o korzystnej morfologii czy o zwiększonej przepuszczalności ściany komórkowej [Galas, 1995; Fiedurek, 2004].
Wysoko wydajny skrining
Wysoko wydajny skrining to technika określana jako HTS (ang. High Throughput Screening), która prowadzi do miniaturyzacji i automatyzacji oraz umożliwia testowanie znacznej liczby próbek. Dzięki opracowanym zminiaturyzowanym testom płytkowym można przebadać kilka tysięcy próbek w mikrostudzienkach, zawierających po ok. 1 μl reagentów [Bednarski, Fiedurek, 2004].
Wysoko wydajne techniki, bez względu od celu zastosowania, umożliwiają równoczesne badanie wpływu licznych czynników, takich jak rodzaj linii komórek, stężenie składników pokarmowych, źródło węgla i azotu, pH czy temperatura na efektywność procesu produkcji. Prowadzenie doświadczeń charakteryzujących się wysokim stopniem automatyzacji umożliwia równoczesne nadzorowanie dużej ilości jednocześnie prowadzonych eksperymentów. Dodatkowo, objętość mieszanin reakcyjnych jest zminimalizowana, co znacznie obniża koszty prowadzonych doświadczeń. Przykładami zastosowań wysoko wydajnych technik mogą być: identyfikacja dzikiej linii komórek wykazujących nową aktywność enzymatyczną, skrining bibliotek komórek pod kątem zwiększonej syntezy metabolitów czy ewolucja enzymów pod kątem zwiększonej specyficzności [Ratledge, Kristiansen, 2011].
Bibliografia:
1. Bednarski W., Fiedurek J.: Podstawy biotechnologii przemysłowej, Wyd. Naukowo- Techniczne, Warszawa 2004.
2. Bednarski W.: Biotechnologia żywności, zagadnienia wybrane, Wydawnictwo ART., Olsztyn 1993.
3. Chmiel A.: Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa 1998.
4. Fiedurek J.: Podstawy wybranych procesów biotechnologicznych, Wyd. UMCS, Lublin 2004.
5. Galas E., Kwapisz E., Polak J.: Metody skriningu mutantów drobnoustrojów przemysłowych, Biotechnologia, 3(30), 104-119, 1995.
6. Ratledge C., Kristiansen B.: Podstawy biotechnologii, Warszawa 2011.
