Autor: Karolina Różaniecka
Od prawie 40 lat analiza zmienności w obrębie DNA jest jednym z głównych kierunków badawczych w analizach molekularnych. W przypadku oceny zmienności DNA wyróżnić można dwa kierunki rozwoju technik i technologii: 1) sekwencjonowanie oraz 2) zastosowanie markerów molekularnych. Rozwój obu tych gałęzi następował równolegle i zarazem bardzo szybko. Do pierwszego ‘połączenia’ tych dwóch podejść doszło w momencie, gdy okazało się, że dane pochodzące z sekwencjonowania DNA zawierają bardzo dużą ilość informacji dotyczących zmienności (szczególnie polimorfizmów pojedynczych nukleotydów – SNPs), które można wykorzystywać jako ogromne zasoby nowych markerów genetycznych (Chee i in. 1996). Od tego czasu nastąpił gwałtowny rozwój wielu zróżnicowanych podejść mających na celu identyfikację SNPs. W pierwszych latach metody te opracowywane były dla organizmów modelowych o zsekwencjonowanych genomach, wyzwaniem było natomiast opracowanie technologii pozwalających na analizę genomów, których sekwencja nie została dotychczas poznana (np. jak miało to miejsce w przypadku większości roślin uprawnych).
Kolejnym wyzwaniem było opracowanie nowych technik obrazowania. Większość metod genotypowania opartych na wykorzystaniu markerów molekularnych bazuje na technikach elektroforetycznych, które nie pozwalają na osiągnięcie wysokiej przepustowości, a ponadto w przypadku technik generujących duże ilości prążków na żelach, trudne było precyzyjne skorelowanie uzyskanego obrazu z wariantami allelicznymi (Jaccoud i in. 2001). Obecnie coraz większe znaczenie mają tutaj metody hybrydyzacji łączące się z technologią mikromacierzy. Technologia ta oparta jest na hybrydyzacji i oferuje szybki obraz genomu często niezależny od znajomości sekwencji DNA (Wenzl i in. 2004). Jedną z technologii wykorzystujących podejście tego rodzaju jest technologia DArT (Diversity Arrays Technology).
Technologia DArT jest techniką markerów DNA opartych na mikromacierzach. Służy ona do wykrywania i genotypowania zmienności genetycznej w całym genomie. DArT pozwala na ocenę dużej ilości polimorfizmów opartych na miejscu restrykcyjnym między genotypami i nie wymaga do zastosowania informacji o sekwencji DNA (Wittenberg i in., 2005). Markery DArT są markerami dominującymi. Źródłem zmienności identyfikowanej przy pomocy technologii DArT są mutacje. W metodzie tej wykorzystywane są narzędzia statystyczne służące do określenia powtarzalności segregacji markerów. Zaletą DArT jest wysoka wydajność i duża liczba markerów uzyskanych w pojedynczym eksperymencie – zwykle otrzymuje się nawet kilka tysięcy markerów. Duża liczba sond umożliwia wykrycie różnic nawet u form silnie spokrewnionych. Technologia ta bardzo prężnie się rozwija dzięki czemu, opracowane zostały liczne mapy genetyczne. W ten sposób powstają ponadto coraz to nowsze mapy, a proces określania sprzężeń markerów z cechami użytkowymi jest usprawniony.
Głównymi etapami w analizach za pomocą technologii DArT według Jaccoud (2001) są:
1. Stworzenie biblioteki genomowej gatunku
2. Opracowanie mikromacierzy na podstawie biblioteki genomowego DNA
3. Przygotowanie próby do analizy
4. Analiza próby
5. Analiza statystyczna wyników
Najczęściej wykorzystywany wariant technologii DArT obejmuje w pierwszym etapie redukcję złożoności genomu poprzez trawienie wyizolowanego DNA za pomocą dwóch enzymów restrykcyjnych: pierwszym z nich jest rzadko tnący enzym PstI, natomiast drugim enzym charakteryzujący się gęstym cięciem (np. TaqI, BstNI, MspI, HpaII, BanII, MseI lub AluI). Enzym PstI jest wrażliwy na metylację, stąd silnie zmetylowane regiony powtarzalne wykluczane są z analizy (Sansaloni i in. 2010). Kolejny etap stanowi ligacja adaptorów oraz specyficzna amplifikacji fragmentów ulegających ligacji. Następnie przygotowane biblioteki wykorzystywane są do stworzenia mikromacierzy, pozwalającej na analizę i identyfikację markerów polimorficznych. Ostatni etap stanowi hybrydyzacja, a następnie skanowanie, obróbka i bioinformatyczna analiza uzyskanych wyników (Jaccoud i in. 2001, Wenzl i in. 2004, Sansaloni i in. 2010).
Innym wariantem technologii DArT jest wykorzystanie sekwencji transpozonowych typu MITE. Sekwencje te są krótkie, liczne oraz bogate w polimorfizmy, dlatego są one stosowane jako markery molekularne. Dla technologii DArT opracowano także metodę wzbogacenia markerami polimorficznymi m.in. dominującymi silicoDArT i kodominującymi SNP. Wiarygodność wyników otrzymywanych w technologii DArT szacuje się na poziomie ok. 99,8% (Pachota i in. 2016).
Obecnie technologia DArT najczęściej opiera się na analizach z wykorzystaniem sekwencjonowania nowej generacji (NGS), czyli DArTseq. W metodzie tej następuje redukcja złożoności genomu poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi i sekwencjonowanie krótkich odczytów (von Cruz i in., 2013). Technologia DArTseq zastępuje etap hybrydyzacji sekwencjonowaniem odbywającym się w systemie Illumina (Kilian i Graner, 2012).
Dzięki zastosowaniu technologii DArT możliwa jest identyfikacja polimorfizmów pojedynczych nukleotydów bez konieczności sekwencjonowania genomu. Ponadto metoda ma szereg zalet, takich jak: możliwość wykorzystania do analizy praktycznie dowolnego genomu, bez względu na jego wielkość, dowolność metodyki redukcji złożoności genomu, możliwość wykorzystania do mapowania genetycznego. Metoda jest relatywnie szybka i prosta, co pozwala na uzyskanie wyników w krótkim czasie, dzięki czemu nadaje się do zastosowania np. w programach hodowli roślin do aplikacji wysokoprzepustowych, jak fingerprinting czy selekcja wspierana markerami (MAS) (Wenzl i in. 2004).
Bibliografia:
1. Chee M., Yang R., Hubbell E., Berno A. Huang X.C., Stern D., Winkler J., Lockhart D.J., Morris M.S., Fodor S.P. 1996. Accessing Genetic Information with High-Density DNA Arrays. Science 274(5287): 610-614
2. Jaccoud D., Peng K., Feinstein D., Kilian A. Diversity Arrays: a solid state technology for sequence information independent genotyping. Nucleic Acids Res. 29(4): e25
3. Kilian A., Graner A. 2012. NGS technologies for analyzing germplasm diversity in genebanks. Brief. Funct. Genom. 11(1): 38–50.
4. Pachota K., Niedziela A., Orłowska R., Bednarek P., 2016. Nowoczesne metody genotypowania DArT i GBS w hodowli gatunków roślin użytkowych. Biul. IHAR 279: 3-38
5. Sansaloni C.P., Petroli C.D., Carling J., Hudson C.J., Steane D.A., Myburg A.A., Grattapaglia D., Vaillancourt R.E., Kilian A. 2010. A high-density Diversity Arrays Technology (DArT) microarray for genome-wide genotyping in Eucalyptus. Plant Methods 6:16
6. von Cruz M., Kilian A., Dierig D.A. 2013. Development of DArT marker platforms and genetic diversity assessment of the U.S. Collection of the new oilseed crop lesquerella and related species. PLoS ONE 8 (5), e64062
7. Wenzl P., Carling J., Kudrna D., Jaccoud D., Huttner E., Kleinhofs A., Kilian A. 2004. Diversity Arrays Technology (DArT) for whole-genome profiling of barley. Proc. Natl. Acad. Sci. 101(26): 9915-9920
8. Wittenberg A.H.J., von der Lee T., Cayla C., Kilian A., Visser R.G.F., Schouten H.J. 2005. Validation of the high-throughput marker technology DArT using the model plant Arabidopsis thaliana. Mol. Genet. Genomics 274(1): 30-39
