biotechnologia


 
 

MLPA

DNA MLPA (ang. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) jest odmianą metody PCR multipleks, która umożliwia wykrycie zmienionej liczby kopii w nawet 50 różnych sekwencjach nukleotydowych podczas jednej, prostej reakcji. Technika ta może być stosowana w większości laboratoriów, bowiem nie wymagany jest żaden specjalistyczny sprzęt, za wyjątkiem termocyklera i zestawu do elektroforezy kapilarnej. Jednocześnie można analizować do 96 próbek, a wyniki są dostępne w ciągu 24 godzin. Delecje lub duplikacje fragmentów DNA stanowią około 5,5% wszystkich opisanych zmian w genomie i są przyczyną wielu jednostek chorobowych, dlatego też włączenie metody MLPA do praktyki klinicznej może znacznie podnieść wykrywalność wielu chorób genetycznych. Metoda MLPA została opracowana w 2002 roku przez firmę MRC Holland, a obecnie używana jest w ponad 900 laboratoriach na świecie.


Zalety MPLA

W porównaniu z innymi technikami zastosowanie MLPA w wykrywaniu liczby kopii ma wiele zalet. Wykrywanie delecji czy duplikacji fragmentów genów, szczególnie tych obejmujących całe egzony, zazwyczaj nie jest możliwe z zastosowaniem techniki PCR czy sekwencjonowania, ze względu na wielkość badanych zmian. Analiza Southern blot pozwala na wykrycie wielu aberracji, nie umożliwia jednak wykrycia mniejszych zmian, dodatkowo używane są sondy znakowane radioaktywnie, więc nie jest idealna jako rutynowa metoda. Porównując MAPA do FISH, niebywałą zaletą tej pierwszej jest to, że badane są bardzo krótkie sekwencje (50-70 nt), co umożliwia wykrycie częstych aberracji obejmujących pojedynczy gen, które są zbyt małe, aby można je było wykryć metodą FISH. Rozwiązaniem może być też zastosowanie techniki array-CGH (ang. Array-Comparative Genomic Hybridization) lub mikromacierzy SNP o wysokiej gęstości (ang. high- density SNP array), które to umożliwiają screening całego genomu, ale wymagają zastosowania specjalistycznego sprzętu, wysoko wykwalifikowanego personelu i są kosztowne. Obecnie komercyjnie dostępnych jest ponad 300 zestawów sond, przeznaczonych do badań dość częstych chorób (dystrofia mięśniowa Duchenne, zespół DiGeorge, SMA), jak i bardzo rzadkich (dziedziczne zapalenie trzustki, wrodzony niedobór antytrombiny, zespół Birt-Hogg-Dube).


Reakcja MLPA

Cechą charakterystyczną MLPA to jest to, że amplifikacji nie ulegają badane sekwencje tylko sondy, które do tych sekwencji hybrydyzowały. W odróżnieniu od typowej reakcji PCR multipleks, w MLPA używana jest pojedyncza para starterów. Uzyskane produkty reakcji amplifikacji zestawu SALSA MLPA to fragmenty o długości od 130 do 480 nukleotydów, które mogą być analizowane poprzez elektroforezę kapilarną. Porównanie uzyskanego wzoru pików do próbek referencyjnych wskazuje, które z badanych sekwencji mają zmienioną liczbę kopii. Do badania potrzebne jest 50-200 ng DNA.

Reakcja MLPA dzieli się na pięć głównych etapów:
1) denaturacja DNA i hybrydyzacja sond MLPA
2) reakcja ligacji
3) reakcja PCR
4) elektroforetyczny rozdział produktów PCR
5) analiza danych

W czasie pierwszego etapu DNA ulega denaturacji, a następnie matryca jest inkubowana z mieszaniną sond MLPA. Sondy MLPA składają się z dwóch oddzielnych oligonukleotydów (sondy połówkowe, z ang. half-probes), a każdy z nich zawiera sekwencje starterów do reakcji PCR. Obie sondy hybrydyzują do badanej sekwencji obok siebie. Tylko w takiej sytuacji mogą zostać połączone w procesie ligacji. Zligowane sondy ulegają następnie amplifikacji podczas reakcji PCR, a jej produkty są rozdzielane w warunkach denaturujących, np. w sekwenatorze kapilarnym. Sondy, które nie uległy reakcji ligacji zawierają sekwencje tylko jednego startera - nie ulegają one amplifikacji i nie generują sygnału. Nie ma potrzeby usuwania niezwiązanych sond. Analiza wyników polega na porównaniu wysokości piku lub pola powierzchni piku uzyskanego dla danej sondy z danymi dla tej samej sondy w próbie kontrolnej. Najczęściej do tego celu używa się odpowiedniego oprogramowania do MLPA, np. dostarczonego przez producenta zestawów. Prawidłowy stosunek wysokości danego piku uzyskanego dla próby badanej oraz piku próby kontrolnego wynosi 10.3. Wynik poniżej tej wartości oznacza delecję, zaś powyżej- duplikację danego fragmentu.


Odmiany MPLA

Methylation-specific MLPA (MS-MLPA) jest metodą półilościową, która służy do badania profilu metylacji. Cechą MS-MLPA jest zastosowanie enzymu restrykcyjnego wrażliwego na metylację. MS-MLPA jest używana do badania wzoru metylacji np. w zespołach Angelmana i Prasera-Willego, Beckwitha-Wiedemanna, a także zmian profilu metylacji w materiale pochodzącym z komórek nowotworowych.

Sam przebieg reakcji MS-MLPA jest bardzo podobny do tradycyjnego MPLA. Różnicą jest to, że wytwarzane są dwie próbki: jedna z nich niezhydrolizowana służy do badania liczby kopii, zaś druga zhydrolizowana - do badania metylacji. Sondy MS-MLPA przypominają zwykłe sondy do MLPA, jedynie sekwencja do której sonda hybrydyzuje zawiera miejsce dla metyloopornej endonukleazy HhaI. Po hybrydyzacji produkty reakcji są rozdzielane do dwóch probówek. W jednej przeprowadza się typową reakcje MLPA, która dostarcza informacji o ewentualnych zmianach w liczbie kopii (ta część nie została pokazana na rys 2.). Druga jest inkubowana z endonukleazą HhaI i zhybrydyzowane sondy ulegają w tym czasie ligacji. Hybrydy sonda – niemetylowane DNA są trawione przez HhaI. Zhydrolizowane sondy nie ulegają amplifikacji podczas reakcji PCR i dlatego nie będą wytwarzały sygnału podczas rozdziału elektroforetycznego. Natomiast, jeśli próbka DNA była metylowana, hybrydy DNA-sonda są zabezpieczone przed hydrolizą enzymem HhaI i zligowane sondy będą generowały pik.


Reverse-Transcriptase MLPA (RT-MLPA) jest odmianą MLPA opracowaną specjalnie do badań poziomu ekspresji na poziomie mRNA. Zmiany ekspresji genów odgrywają istotną rolę w rozwoju i różnicowaniu się komórek, a także w procesach patologicznych. Obecnie dostępne są zestawy SALSA RT-MLPA służące do badania genów związanych z apoptozą i procesem zapalnym. RT-MLPA w porównaniu z innymi technikami badania poziomu ekspresji tj. Northern blot, PCR w czasie rzeczywistym czy mikromacierze przedstawia szereg zalet. Po pierwsze, pozwala na szybka analizę licznych próbek w standartowym 96 dołkowym formacie. Po drugie, analiza RT-MLPA jest prosta i do badania wystarcza nawet 5-10 ng mRNA.


Proces rozpoczyna się od reakcji odwrotnej transkrypcji. Każdy zestaw SALSA RT-MLPA zawiera specjalnie zaprojektowane RT-startery, które przyłączają się w pobliżu lub nawet obejmują sekwencje rozpoznawaną przez sondę, co prowadzi do odwrotnej transkrypcji krótkich fragmentów mRNA do cDNA. Po tym etapie kontynuowana jest typowa reakcja MLPA, zaczynająca się od hybrydyzacji sond do ich docelowych cDNA. Jeśli to tylko możliwe, sondy RT-MLPA są tak zaprojektowane, aby obejmowany granicę ekzonów: jedna część sondy może hybrydyzować do końcowych 25 nukleotydów ekzonu 1, podczas gdy druga hybrydyzuje do pierwszych 35 nukleotydów ekzonu 2. Takie "mostkowanie" intronu uniemożliwia sondzie generowanie sygnału z zanieczyszczeń genomowym DNA, który jest często obecny w próbkach RNA.


Ograniczenia metody

Jak każda z metod, również i ta ma swoje ograniczenia. Są nimi:
• konieczność stosowania zestawów komercyjnych,
• konieczność potwierdzania wyniku z zastosowaniem innej metody w przypadku wyników diagnostycznych
• zależność ilości produktu PCR od: stężenia i czystości DNA, metody jego izolacji, rodzaju roztworu, w którym jest rozpuszczone, czasu przechowywania i stopnia degradacji DNA, obecności innych związków w roztworze. Wpływ tych czynników można zmniejszyć poprzez standaryzację metod izolacji i przechowywania DNA.


Zastosowanie MLPA

Metoda ta jest szeroko wykorzystywana w diagnostyce niepełnosprawności intelektualnej o nieznanej etiologii, diagnostyce aneuploidii czy badaniach nowotworów - zarówno delecji i duplikacji krytycznych obszarów, jak i badaniu poziomu metylacji. Wzrastająca liczba publikacji na temat MPLA świadczy o tym, że jest ona użyteczną techniką laboratoryjną analizy genomu i doskonale uzupełnia inne techniki w tej grupie.


Zobacz również:
PCR
RT-PCR
Real-time PCR
Multipleks PCR
Nested PCR


Autor: Karolina Podsiadły


Literatura:
1. Łaczmańska I., Łaczmański Ł.: Metoda MPLA oraz jej zastosowanie w diagnostyce chorób uwarunkowanych genetycznie. Postępy Biologii Komórki. Tom 36 2009, nr 4 (559-563)
2. www.mlpa.com


Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

124 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u