biotechnologia


 
 
UWAGA. Artykuł jest poniżej.

Drodzy Czytelnicy e-biotechnologia.pl. Mamy do Was ogromną prośbę!



Portal ten tworzony jest przez lubelskich naukowców i od ponad 10 lat staramy się, aby w Wasze ręce trafiały treści, które pomagają Wam w zdobywaniu wiedzy.
Dzisiaj My prosimy Was o pomoc i przysługę!
Ci sami naukowcy, którzy tworzą e-biotechnologia.pl tworzą również projekt NEXBIO.
NEXBIO rozwija technologie analizy DNA, które mają szansę obniżyć użycie pestycydów w rolnictwie. Ponadto budujemy mobilne laboratorium genetyczne, które umożliwi wykrywanie chorób roślin już na polu. Więcej o nas tutaj: Onet Rano, INN:Poland, Chivas Venture NEXBIO.

NEXBIO reprezentuje Polskę w niezwykle prestiżowym konkursie THE VENTURE rywalizując w gronie 30 innowacyjnych pomysłów z całego świata. Mamy szansę wygrać, ale nie odbędzie się to bez Waszej pomocy. Prosimy Was o głosy w konkursie. To dla nas wielka szansa! Dla nas to fundusze na rozwój projektu jakim jest mobilne laboratorium genetyczne. Jeśli nas wesprzecie, bardzo prawdopodobne jest, że za kilka lat, również będziecie z niego korzystać.

Jak można na nas zagłosować (to zajmie tylko kilka sekund!):


1. Należy wejść na stronę organizatora konkursu: Konkurs The Venture
2. Kliknąć w przycisk Zaloguj się przez Facebook aby oddać głos
3. I następnie koniecznie kliknąć w przycisk Potwierdź swój głos

Bardzo Wam dziękujemy!
ZESPÓŁ E-BIOTECHNOLOGIA.PL
 

PCR

Reakcja PCR (polymerase chain reaction), łańcuchowa reakcja polimerazy, jest techniką, przy użyciu której możemy powielić dowolny fragment DNA o długości od kilku do kilkuset tysięcy nukleotydów. PCR został opracowany w połowie lat 80-tych (1983) przez Kary'ego Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus. Za to osiągniecie Mullis otrzymał Nagrodę Nobla (1993 r.).
Łańcuchowa reakcja polimerazy polega na przeprowadzeniu wielu cyklicznych reakcji syntezy nici DNA w tzw. termocyklerze. Tremocykler jest urządzeniem służącym do sterowania temperaturą. Probówki znajdujące się w termobloku raz są podgrzewane, a raz oziębiane. Zakres zmiany temperatury zależy m.in. od długości odcinka DNA, który planujemy powielić, od długości starterów oraz optimów temperaturowych enzymów (polimeraz). Sterowanie temperaturą możliwe jest dzięki wprowadzeniu do pamięci termocyklera określonego programu, zazwyczaj podanego w opisie metodyki, na podstawie której powielamy badany DNA. Okresowe zmiany temperatury wywołują różnego typu reakcje chemiczne, które zachodząc cyklicznie (np. 35 cykli), doprowadzają do powielenia, określonego przez primery (startery), fragmentu DNA. Tak otrzymany produkt poddajemy dalszej analizie.

termocykler
Nowoczesny termocykler z panelem dotykowym (fot. Adam Kuzdraliński)

PCR znajduje wiele zastosowań. Wymienić tutaj należy: klonowanie genów, diagnostykę kliniczną, kryminalistykę, identyfikację osób zaginionych, paleontologię, ustalanie ojcostwa czy diagnostykę chorób dziedzicznych. Wykorzystujemy go często w sytuacji, kiedy dysponujemy niewielką ilością materiału badanego.


Przebieg reakcji PCR


Aby doszło do namnożenia fragmentu DNA musimy posiadać odpowiednie składowe reakcji, bez których doświadczenie nam się nie uda. Te elementy to:

- wyizolowana, o odpowiedniej czystości nić DNA (z tkanek, z krwi, z włosów itp.);
- środowisko reakcji (bufor, jony magnezowe oraz odpowiedniej czystości woda);
- primery (inaczej startery, czyli kilku do kilkunastu nukleotydowe sekwencje flankujące znany lub nieznany odcinek DNA);
- dNTP (wolne nukleotydy);
- termostabilna (nie ulegająca degradacji w wysokich temperaturach) polimeraza DNA
- opcjonalnie: substancje stabilizujące polimerazę (w gotowych zestawach, tzw. kitach, substancje stabilizujące znajdują się zazwyczaj w buforach dostarczanych razem z polimerazą).

Gdy dysponujemy wszystkimi elementami przystępujemy do pracy. Do probówek wprowadzamy, przy użyciu pipet oraz tipsów jednorazowego użytku, substancje o odpowiedniej objętości i stężeniu (rzędu mikrolitrów). Kolejność wprowadzania składników jest ważna. Zmiana kolejności dodawania składników może być przyczyną otrzymywania produktów niespecyficznych, a czasem obniżenia aktywności niektórych elementów mieszaniny. Stąd też, rozpoczynamy od wprowadzenia do probówek: wody, buforu, jonów magnezowych, wolnych nukleotydów (dNTP), primerów – często dwóch (jeden syntetyzujący od końca 3’ , a drugi od końca 5’), a następnie dodajemy wyizolowane, o odpowiedniej czystości DNA (mówimy tutaj o typowej reakcji PCR). Najczęściej na samym końcu dodajemy polimerazę. Ze względu na cenę, jest nią zazwyczaj izolowana z bakterii Thermus aquaticus - polimeraza Taq.
Przygotowując większą ilość prób do reakcji, możemy sporządzić mieszaninę o większej – wyliczonej wcześniej – objętości, składającą się z: wody, buforu, jonów magnezowych, primerów, wolnych nukleotydów oraz polimerazy DNA. Tak przygotowaną mieszaninę rozpipetowujemy do probówek przeznaczonych do PCR, następnie do każdej z nich wprowadzamy określoną ilość DNA. Należy pamiętać o dokładnym oznaczeniu probówek!

Gdy w probówkach znajdą się już wszystkie składniki mieszaniny reakcyjnej, przenosimy je do termocyklera, uruchamiamy określony program (wprowadzony wcześniej do pamięci urządzenia) i czekamy do zakończenia reakcji (np. 2,5 godziny). Po zakończeniu procesu, z termobloku wyjmujemy probówki. Reakcję możemy pozostawić w urządzeniu na noc, pamiętajmy jednak o ustawieniu termocyklera tak, aby po zakończonym PCR utrzymywał próbki w temperaturze 4 stopni C. W przypadku modyfikacji PCR, metody PCR-RFLP, do każdej z prób dodajemy enzym restrykcyjny (np. AluI, HaeIII, EcoRI lub inne), którego zadaniem będzie pocięcie – otrzymanych np. w wyniku łańcuchowej reakcji polimerazy – fragmentów, na odcinki różnej długości.

Cięcie następuje w miejscach restrykcyjnych, rozpoznawanych przez enzym, stąd też gdy brak będzie takich miejsc – brak będzie produktów reakcji, a po elektroforezie na żelu zauważymy jedynie pojedyncze prążki, bez rozdziału na frakcje różniące się długością.

Po okresie inkubacji z enzymem (najczęściej w temperaturze 36 stopni C) przenosimy badany DNA na żel agarozowy lub poliakryloamidowy i poddajemy rozdziałowi elektroforetycznemu. Rozdziału dokonujemy w obecności bromku etydyny, który świeci pod wpływem promieni UV.

Zdolność bromku etydyny zarówno do wnikania pomiędzy zasady azotowe DNA jak i emitowanie promieniowania pod wpływem UV, pozwoliło wykorzystać go jako znacznik do wizualizacji efektów reakcji PCR.

Otrzymane w postaci świecących prążków wyniki archiwizujemy, a następnie poddajemy dalszej analizie, statystycznej bądź też innej.

dna
Bromek etydyny świeci w świetle UV (fot. Adam Kuzdraliński)

Przebieg reakcji PCR


W wysokiej temperaturze (zwykle około 95°C) dochodzi do denaturacji podwójnej nici DNA (rozdzielenia się na dwie) . Jest to wynik pękania wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi (purynami i pirymidynami). W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (najczęściej przedział pomiędzy 45-65°C), następuje ich asocjacja do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje przyłączenie się polimerazy DNA do miejsca asocjacji starterów z matrycą DNA. Powstały kompleks rozpoczyna syntezę nici komplementarnej do matrycy. Po zakończeniu pierwszego cyklu reakcji następuje kolejny, czyli: denaturacja, przyłączanie starterów oraz synteza nici DNA. Po ostatnim cyklu, w temperaturze 72 stopni C, przez okres zazwyczaj 5 minut następuje końcowe wydłużanie.


Warunki reakcji PCR


25 µl - całkowita objętość próby
w tym:
- 100 ng (zazwyczaj 1 µl) DNA;
- 15 pmol każdego z primerów;
- 100 µM dNTP;
- 1.5 mM MgCl2
- 0.6 U Taq DNA polimerazy, w standardowym buforze do PCR


Przykładowe warunki temperaturowe łańcuchowej reakcji polimerazy:


- 94 stopni C przez 5 min - wstępna denaturacja
- 94 stopni C przez 40 s - denaturacja nici
- 60 stopni C przez 40 s - przyłączanie starterów do nici DNA
- 72 stopni C przez 40 s - przyłączenie polimerazy do dupleksu primer-matryca i synteza łańcucha
- (35 cykli)
- ostatnie wydłużanie w 72 stopni C przez 5 minut.

Gdyby wydajność reakcji PCR była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2 do n-tej potęgi cząsteczek DNA. W praktyce wydajność reakcji PCR jest nieco mniejsza. Nie zmienia to jednak faktu, że PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie pożądanego odcinka łańcucha DNA oraz to, że metoda ta jest bardzo czuła.


Przydatne informacje związane z reakcją PCR


- Jony magnezowe występują przeważnie w postaci chlorków lub siarczanów.

- Woda wykorzystywana do reakcji PCR powinna być świeżo destylowana, dejonizowana, filtrowana przez filtr 0,22 μm i autoklawowana.

- Nukleotydy chelatują jony magnezowe, dlatego też dodaje się nadmiar jonów magnezowych.

- BSA, siarczan amonu, Triton, DTT, stabilizują polimerazę, modyfikują oddziaływanie matryca-primer.

- Ze względu na degenerację kodu genetycznego, przygotowywane na bazie sekwencji aminokwasowej primery powinny składać się ze wszystkich możliwych kombinacji kodonów dla danego aminokwasu.

- Stopień zdegenerowania jest iloczynem możliwej liczby kodonów dla wybranej sekwencji aminokwasowej.

- Temperatura topnienia jest to temperatura dysocjacji dupleksu primer-matryca.

- Gorący start służy ograniczeniu hybrydyzacji niespecyficznej. Polega na dodaniu ostatniego odczynnika, najczęściej polimerazy, po uprzednim podgrzaniu próbki.

- Wartość temperatury topnienia rośnie wraz z ze wzrostem zawartości cytozyny i guaniny w łańcuchu. Jest to spowodowane tym, iż pomiędzy tymi zasadami występuje po trzy wiązania wodorowe, natomiast pomiędzy adenina i tymina tylko dwa.

- Przy projektowaniu primerów należy zwrócić uwagę na to, by nie miały sekwencji palindromu. W przeciwnym wypadku może dojść do hybrydyzacji w obrębie pojedynczego startera.

- Polimeraza Taq - enzym ten popełnia dużo błędów, dlatego też nie poleca się go do klonowania oraz tworzenia konstrukcji genowych. Charakteryzuje go brak aktywności egzonukleolitycznej 3’-5’ – jednego z mechanizmów korekcji błędów.

- Najmniej błędów możemy spodziewać się stosując polimerazę Pfu (pochodzi z Pyroccus furiosus), enzym ten wykazuje aktywność egzonukleolityczną.

- Aktywność egzonukleolityczna zmniejsza szybkość i wydajność reakcji PCR, dlatego też często stosuje się mieszaniny polimeraz np. Taq + Pfu.

- Polimeraza Taq nie generuje tępych końców. Na końcach zsyntetyzowanego DNA pozostawia dwie adenozyny.

- Reakcja PCR wykazuje wysoką czułość. Nawet pojedynczy egzemplarz poszukiwanej sekwencji powinien zostać amplifikowany. W praktyce czułość ta jest jednak niższa co spowodowane jest obecnością inhibitorów polimerazy DNA, które pochodzą z tkanek.

- W reakcji PCR używamy nadmiaru primerów, po to aby zapobiec renaturacji matrycowego DNA.

- W zależności od tego, jakiej długości odcinki DNA będziemy rozdzielać, dobieramy odpowiednie stężenie żelu agarozowego:


Stężenie agarozy [%] Długośc rozdzielanego DNA [pz]
0,3 5000 - 60 000
0,6 1000 - 20 000
0,7 800 - 10 000
0,9 500 - 700
1,2 400 - 600
1,5 200 - 300
2,0 100 - 200



Modyfikacje reakcji PCR


W zależności od tego, jakimi informacjami dysponujemy na temat badanego DNA, oraz jakie efekty chcemy uzyskać, stosujemy różne modyfikacje PCR. Wymagają one nieco odmiennych składników mieszaniny reakcyjnej oraz innych warunków przeprowadzanych reakcji. Nie należy zapominać, że również w obrębie jednej stosowanej techniki, np. wspomnianej wyżej reakcji PCR-RLFP, warunki temperaturowe reakcji czy sekwencje starterów będą inne dla każdego badanego odcinka nici DNA.

PCR-RFLP
RAPD-PCR
PCR-CCM
PCR-PTT
RT-PCR
ACRS-PCR
ARMS-PCR
ASA-PCR
PCR-ASO
PCR-HD
PCR-SSCP
PCR-DGGE
PCR-TGGE
inversed PCR
PCR-OLA
REP-PCR
Real-Time PCR


Zobacz również:
RT-PCR
Real-time PCR
Multipleks PCR
Nested PCR
MLPA PCR


Marcin Pastwa

Literatura:
Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej. Praca zbiorowa pod redakcją J. Bala. Polskie Wydawnictwo Naukowe 2008.
Genetyka Molekularna. Praca zbiorowa pod redakcją Piotra Węgleńskiego. Polskie Wydawnictwo Naukowe 1995.
Genomy. Brown T.A. Polskie Wydawnictwo Naukowe 2001.
Effect of the polymorphism of prolactin receptor (PRLR) and leptin (LEP) genes on litter size in Polish pigs” - A. Terman, J. Anim. Breed. Genet. 122 (2005) 400–404
.


Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

156 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Patronat

Wydarzenie: V edycja akcji „Od laika do przyrodnika” 24 lutego -16 czerwca 2017 r., Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu

Konferencja: IV Lubelska Konferencja Młodych Naukowców, 26-27 Maja 2017, Lublin

Konferencja: VI Międzynarodowa Konferencja Biofizyków, 19-21 Maja 2017, Kraków

Konkurs na projekt badawczy Naukowej Fundacji Polpharmy, 1 marca- 31 maja 2017, Warszawa

Konferencja: VI Międzyuczelniane Sympozjum Biotechnologiczne SYMBIOZA, 26-28 Maja 2017, Warszawa

Konferencja: Chemia dla Urody i Zdrowia
8-10 czerwca 2017, Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu

Wydarzenie: Metagenomy różnych środowisk, 29-30 czerwca 2017, Lublin

Wydarzenie: EUROBIOTECH 6th Central European Congress of Life Science
11 - 14 Września 2017, Kraków

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u