biotechnologia


 
 

RT-PCR

przeciwciało Przyjęło się, że sztandarowym zadaniem biologii molekularnej jest określenie sekwencji genomu, ale jak się okazało sekwencja genomu to jeszcze nie wszystko. Jednym z podstawowych celów stało się zrozumienie, co genom zawiera i jak funkcjonuje. Pierwszy osiąga się najczęściej poprzez połączenie analizy komputerowej i eksperymentalnej, których podstawowym celem jest lokalizacja genów i ich obszarów kontrolnych oraz ustalenie roli każdego genu. Drugi cel, zrozumienie funkcjonowania genomu, to w pewnym sensie tylko inny sposób postawienia problemów, którymi zajmujmowała się biologia molekularna przez ostatnich 30 lat. Dawniej jednak uwaga skierowana była na szlaki ekspresji poszczególnych genów, a grupy genów rozważano tylko wtedy, gdy ekspresja jednego genu związana była z ekspresją innego. Obecnie stawia się bardziej ogólne pytania związane z ekspresją genomu jako całości.

Pierwszym etapem ekspresji genów jest kopiowanie genów na transkrypt RNA. Najbardziej bezpośrednim sposobem dowiedzenia się, czy gen jest włączony, było by więc zbadanie, czy transkrypt genu jest obecny w komórce lub tkance. Istnieje ku temu wiele technik,np.:

- hybrydyzacja metodą Northern,
- elektroforeza w żelu agarozowym w warunkach denaturujących,
- znakowanie cząsteczek RNA poprzez kopiowanie RNA na matrycy DNA w obecności znakowanych nukleotydów,
- sekwencjonowanie RNA – trudne i nadające się jedynie do małych cząstek.

Podstawową wadą wszystkich tych technik jest praca z RNA, które bardzo łatwo ulega degradacji. Częściowo wady tej pozbawiona jest metoda RT-PCR będąca modyfikacją zwykłej PCR.

Podstawowe cechy i zalety Reverse Transcriptase PCR:
- umożliwia utworzenie cDNA na matrycy RNA
- cDNA jest znacznie stabilniejszy niż RNA
- cDNA może być amplifikowany za pomocą PCR

Wrażliwe metody wykrywania i analizy rzadkich transkryptów mRNA lub innych rodzajów RNA stają się coraz ważniejszym aspektem dzisiejszej biologii molekularnej. RNA nie może być podstawą dla reakcji PCR i wymagane jest użycie odwrotnej transkryptazy w celu przeprowadzenia reakcji odwrotnej transkrypcji, w wyniku której powstaje cDNA. cDNA może być bezproblemowo amplifikowane. RNA zostaje niejako z powrotem przepisane w gen, z którego uległo transkrypcji. Za pomocą RT-PCR możemy powielać transkrypty dowolnych genów.
RT-PCR dzieli się na dwa zasadnicze etapy: reakcja odwrotnej transkrypcji z udziałem odwrotnej transkryptazy oraz amplifikacja – czyli wykładnicze zwielokrotnienie ilości cDNA.

Składniki mieszaniny wymagane do przeprowadzenia reakcji RT-PCR:
- RNA
- promery (startery)
- dNTPs
- bufor
- odwrotna transkryptaza
- polimeraza Taq

Odwrotna transkryptaza (odkryta przez Temin’a i Baltimore’a na początku lat 60-tych) jest enzymem używanym przez wszystkie retrowirusy i retrotranspozony, który przepisuje genetyczną informację z wirusa albo retrotranspozonu (z RNA do DNA). Dzięki czemu może zintegrować się z genomem. Eukaryota posiadając linearny DNA używają wariantu odwrotnej trakskryptazy zwanego telomerazą – z szablonem RNA zawartym w samym enzymie. Enzym ten zawiera RNA zależną polimerazę DNA i DNA zależną polimerazę DNA, które pracują razem przeprowadzając transkrypcję w odwrotnym kierunku.

Zanim przeprowadzimy syntezę cDNA musimy posiadać odpowiednie matryce mRNA. Wyizolowany RNA powinien charakteryzować się wysoką jakością i powinien być wolny od zanieczyszczeń. Trzy, najczęściej używane metody pozbywania się zanieczyszczeń: trawienie DNazami, ekstrakcja mieszana z użyciem fenolu i chloroformu oraz strącanie za pomocą chlorku litu. Jednakże, ponieważ RT-PCR amplifikuje nawet bardzo małą ilość materiału – niewielkie uszkodzenie RNA jest tolerowane przez procedurę. Pierwsza nić syntetyzowana jest od primera z ang. reverse primer.
RT-PCR może być użyty do analizy ilościowej (quantitive) lub pół-ilościowej(semi-quantitative). Analiza pół-ilościowa pozwala nam określić, czy jeden transkrypt ulegał większej ekspresji niż inny natomiast ilościowa pozwala nam określić całkowitą ilość danego transkryptu w badanym materiale.
Metoda pół-ilościowa opiera się na użyciu wewnętrznej kontroli tj. transkryptu genu, który ulega bardzo wysokiej i stałej ekspresji (we wszystkich użytych przez nas próbkach ekspresja musi być stała). Poziom ekspresji musi być na tyle wysoki, aby odrzucić zmienność warunków reakcji jako czynnik wpływający na ilość tego RNA. Często takim „kontrolnym” RNA jest np. 18S rRNA (mała podjednostka rybosomu Eucaryota). Produkty PCR wraz z kontrolą poddaje się elektroforezie.

Elementy istotne z punktu widzenia RT-PCR:
- odpowiednio dobrana kontrola
- primery nie mogą ze sobą współzawodniczyć
- amplifikacja nie może dojść do końca reakcji – musi być przerwana wcześniej zanim „wyjdzie” z fazy wykładniczej.
Metoda pół-ilościowa może być używana do określenia obecności lub nieobecności danego transkryptu, określenia jego ilości, klonowania, tworzenia bibliotek cDNA, konstrukcji sond i wiele innych.

Przykłady zastosowania RT-PCR:
1.RT-PCR przeprowadzono na całym mitochondrialnym (mt)RNA pochodzącym z sadzonek pszenicy i kultur tkankowych. Badano obecność genu rps13, który koduje rybosomalne białko S13, oraz genu atp6, który koduje podjednostkę 6 kompleksu syntazy ATP. Wyniki: kultury in vitro mogą utrudniać potranskrypcyjną regulację ekspresji genów. Produkty amplifikacji wklonowano w plazmidowy wektor pUC19.
2. Analiza ekspresji białka - gluteniny w rozwijającym się ziarnie pszenicy (cecha: najczęściej analizowane są zboża we wczesnych etapach rozwoju tj.ziarna, sadzonki). RT-PCR został użyty ponieważ jest bardzo wrażliwą metodą pozwalającą na badanie bardzo blisko spokrewnionych genów – należących do tej samej rodziny, których odróżnienie poprzez hybrydyzację mogłoby okazać się niemożliwe (bardzo bliskie podobieństwo sekwencji uniemożliwia prawidłową hybrydyzację)
3. Badanie ekspresji genu związanego z kiełkowaniem, kodującego karboksypeptydazę serynową podczas różnicowania tkanki naczyniowej w ziarnach pszenicy i jej sadzonkach. RT-PCR było przeprowadzone na całym RNA wyizolowanym z wyselekcjonowanych ziaren aleuronowych, tarczek rosnących ziaren pszenicy oraz kiełków i korzeni z rozwijających się sadzonek.
4.Transaktywacja kukurydzianego transpozonu (Ds) w transgenicznej pszenicy, w której ekspresji ulegał gen transpozazy (Ac). Całe RNA uzyskano z 0,5g liści (Ac transformants – czyli transgeniczna z transpozazą). Ekspresję tego genu określono za pomocą metody Northern-blot i RTPCR. Przeprowadzono 25 cykli PCR.
5. Przeprowadzono analizę wzorów ekspresji dwóch genów ekspansyn pomidora: LeExp1 i LeExp18 w korzeniach porażonych mątwikiem ziemniaczanym (G. rostochiensis). Analiza obejmowała badania ich ekspresji na poziomie mRNA metodami in vitro i in situ. Metodą RTPCR in vitro stwierdzono obecność transkryptów obu genów zarówno w roślinach nie porażonych jak i porażonych larwami nicienia. W nie porażonych roślinach pomidora metodą RTPCR in vitro wykryto silną ekspresję LeExp1 w czerwonym owocu, a słabą ekspresję tego genu w kwiatach, korzeniu i zielonym owocu oraz liściu. Tą samą metodą wykryto ekspresję genu LeExp18 w liściu, kwiatach, korzeniu oraz zielonym i czerwonym owocu.
6. Badania paleoepidemiologiczne - zastosowano reakcję RT-PCR - polegającą na amplifikacji (PCR) cząsteczek cDNA (komplementarny DNA) zsyntetyzowanych (odwrotna transkrypcja - RT) na matrycy RNA. Powielano RNA odzyskany z komórek zachowanych w parafinie oraz pochodzących z pochowanych w wiecznej zmarzlinie zwłok osób, których śmierć spowodowała druga fala grypy hiszpanki. Okazało się, że śmiertelna dla człowieka odmiana grypy powstała w ptakach, a jej rezerwuarem było przypuszczalnie ptactwo wodne. Niestety śladowe ilości zachowanego RNA nie pozwoliły ustalić, dlaczego była ona tak niebezpieczna dla człowieka i kiedy powstała.


Zobacz również:
PCR
Real-time PCR
Multipleks PCR
Nested PCR
MLPA PCR


Literatura:
1. „Genomy” T.A. Brown
2. Alain Takvorian, Jean Luc Coville, Najat Haouazine-Takvorian, Andre Rode, Caroline Hartmann (1997) „The wheat mitochondrial rps13 gene: RNA editing and co-transcription with the atp6 gene”
3. S.B.Altenbach (1998) „Quantification of indyvidual low-molecular-weight glutenin subunit transcripts in developing wheat grains by coompetitive RT-PCR”
4. Fernando Dominguez, Maria Cruz Gonzales, Francisco J. Cejudo (2002)„A germination-related gene encoding a serine carboxypeptidase is expressed during the differentiation of the vascular tissue in wheat grains and seedlings”
5. S.Takumi, K.Murai, N.Mori, C.Nakamura (1998) „Trans-activation of a maize Ds. transposable element in transgenic wheat plants expressing the Ac transposase gene”.

Komentarze

Widok Uszereguj
Tylko zarejestrowani mogą dodawać komentarze. Zarejestruj się/Zaloguj

Podręcznik biotechnologii

Kto jest online

217 gości oraz 0 użytkowników online.

Jesteś niezarejestrowanym lub niezalogowanym użytkownikiem.


 

Facebook

Gadżety

Sklep e-biotechnologia.pl
Tematyczne kubki, koszulki, bluzy etc.


Zapraszamy do sklepu

Na skróty

Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Narodowe Centrum Nauki Narodowe Centrum Badań i Rozwoju Ośrodek Przetwarzania Informacji PAP - Nauka w Polsce Forum Akademickie Fundacja na rzecz Nauki Polskiej Wirtualna Biblioteka Nauki Scopus NCBI PubMed Nature Science Cell

 
 
Partnerzy:

laboratoria.net Nauka w Polsce Academio Fundacja NanoNet BioCen - BioCentrum Edukacji Naukowej Notatek.pl cebioforum.com materialyinzynierskie.pl Wspieram.to - POLSKI KICKSTARTER - Polska platforma finansowania społecznoœciowego.Tu zrealizujš się Twoje pomysły. VitaInSilica Portal popularnonaukowy

Portal: Redakcja . Współpraca . Kontakt . Polecamy



Wszystkie prawa zastrzeżone 2006-2016 e-biotechnologia.pl
stat4u